甄珍， 竇迎港， 劉曉蘭

1.哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心綜合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161005；2.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003；3.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161005

飼料及飼料添加劑的轉(zhuǎn)基因檢測是該領(lǐng)域的難點(diǎn)之一[1]，飼料成分復(fù)雜，包含多種動植物成分，再加上各種深加工產(chǎn)品相互混合，樣品成分復(fù)雜。樣品的復(fù)雜性直接決定了核酸的提取難度，一般的核酸提取方法很難得到理想的可供下游檢測所需的DNA。

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是我國玉米加工副產(chǎn)品之一，是玉米經(jīng)過浸泡后分離粗淀粉乳，得到蛋白質(zhì)水，再經(jīng)過濃縮、脫水分離、干燥后得到的產(chǎn)品[2]，主要用作蛋白飼料。近年來，黑龍江省玉米蛋白粉等玉米飼料產(chǎn)品的出口額度逐年增加，主要出口俄羅斯、韓國、日本等國家。在進(jìn)出口貿(mào)易中對轉(zhuǎn)基因含量有嚴(yán)格的規(guī)定，歐盟規(guī)定飼料轉(zhuǎn)基因含量需＜0.9%，韓國＜3%，日本＜1%，俄羅斯則規(guī)定不得含有轉(zhuǎn)基因成分，而飼料樣本本身的復(fù)雜性給進(jìn)出口產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的檢測工作帶來了巨大的壓力和挑戰(zhàn)。在出口貿(mào)易中多次出現(xiàn)產(chǎn)品中含有轉(zhuǎn)基因成分（假陰性產(chǎn)品）被退回的情況，使得企業(yè)經(jīng)濟(jì)受損且嚴(yán)重影響國家形象。玉米蛋白粉轉(zhuǎn)基因檢測難點(diǎn)主要集中在核酸提取問題上，玉米在加工過程中經(jīng)過一系列物理或化學(xué)試劑處理后DNA 受到不同程度的破壞，且雜質(zhì)含量高，這就造成了提取DNA 過程中要面臨核酸濃度極低和嚴(yán)重不純的問題，現(xiàn)有檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及試劑盒的提取方法對玉米飼料產(chǎn)品的核酸提取均具有局限性（假陰性問題），無法滿足出口檢驗(yàn)要求，因此，如何在現(xiàn)有的檢驗(yàn)方法基礎(chǔ)上更有效地檢測出轉(zhuǎn)基因成分已成為研究重點(diǎn)。本研究基于口岸進(jìn)出口飼料產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢測需要，針對性探討了適合于該類樣本的核酸提取方法，旨在為飼料、飼料添加劑等產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測工作提供質(zhì)量穩(wěn)定、適合下游多種檢測方式的核酸樣本。

1 材料與方法

1.1 原料及試驗(yàn)樣品

1.1.1 試驗(yàn)樣品 原料玉米在溫度為（50±2）℃的環(huán)境下，經(jīng)過濃度為0.07%～0.18%的亞硫酸浸泡（浸泡時(shí)間≥26 h），浸泡后進(jìn)行破碎、胚芽分離、精磨，精磨后得到精漿液，精漿液經(jīng)過分離、濃縮離心、干燥得到含水量為55%～60%的產(chǎn)品，即為玉米蛋白粉。

本試驗(yàn)所采用樣品均來自飼料加工廠，樣品狀態(tài)穩(wěn)定。提取DNA 所用玉米蛋白粉為經(jīng)60 ℃烘箱4 h后的干制粉末，核酸提取前使用密閉法對樣品進(jìn)行分裝，以保證樣品的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。送檢12 批次樣品均來自日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的玉米蛋白粉。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 ERM-BF413ak MON 810 MAIZE blank、ERM-BF413ck MON 810 MAIZE （level 1-nominal 0.5 % GMO）均購自歐洲委員會標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和測量研究院。

1.2 主要試劑

1.2.1 核酸試劑盒 7 種市售試劑盒如表1所示。

表1 市售7種試劑盒信息Table1 Information of seven commercially available kits

1.2.2 反應(yīng)試劑 Premix Ex TaqTM（Probe qPCR，TaKaRa 公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，Sigma-Aldrich 公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，Sigma-Aldrich 公司）；三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇等試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）均為分析純或生化級試劑；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2.3 引物探針 引物及探針合成、標(biāo)記均為TaKaRa 公司產(chǎn)品，引物及探針序列根據(jù)SN/T1204-2016[3]標(biāo)準(zhǔn)中zSSIIb基因、MON810 特異性序列進(jìn)行檢測。

1.3 方法

1.3.1 樣品中DNA 提取 ①對照試劑盒法：按照各核酸提取試劑盒說明書的方法進(jìn)行試驗(yàn)樣品中DNA 提取,提取的過程注意防止交叉污染。其中樣品量為每個(gè)試劑盒提取10×100 mg 樣品，在DNA 富集步驟中進(jìn)行合并，最后統(tǒng)一用80 μL 雙蒸水進(jìn)行洗脫，獲得樣品DNA。

②對照CTAB 法：稱取1 g 樣品干粉，按照農(nóng)業(yè)部 1485 號公告-4-2010[4]提取 DNA，用 80 μL 雙蒸水溶解DNA。

③改良SDS-CTAB 提取法：稱取1 g 樣品干粉，置于50 mL離心管中，加入6 mL的SDS裂解液（2.5%SDS，0.5%PVP，1 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）10 mmol·L-1β-巰基乙醇。）充分震蕩混勻；置于電熱恒溫水槽中65℃ 溫育90 min，每隔5～10 min 混勻1 次；加入 3 mL 5 mol·L-1KAC（pH 6.0），并置于0 ℃冰浴 20 min；加入 2 mL CTAB 裂解液[2%CTAB，1.4 mol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L-1EDTA（pH 8.0）]，混 勻 ，65 ℃水浴30 min；加入6 mL 25∶24∶1 的苯酚∶氯仿∶異戊醇溶液，置搖床上充分混勻后靜置10 min；13 000 g 離心 20 min 后，取全部上清液至新的50 mL 離心管中；重復(fù)抽提2次，轉(zhuǎn)移至新的10 mL 離心管中；加入1/3 體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20 ℃ 放置4 h；25 ℃，13 000 g 離心20 min，棄上清，轉(zhuǎn)移至新的2 mL 離心管中；1.5 mL 無水乙醇洗滌沉淀2 次，每次10 min，通風(fēng)柜風(fēng)干沉淀1 h；加 80 μL 雙蒸水，37 ℃水浴 30 min 溶解 DNA后置4 ℃冰箱備用。

1.3.2 DNA 質(zhì)量檢測 取 2 μL 提取的 DNA 用Denovix DS-11+測定其濃度、A260/A280和A260/A230的比值，以評估提取DNA 的質(zhì)量和雜質(zhì)去除情況。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系及程序 實(shí)時(shí)熒光 PCR 采用 25 μL 的總體系：Premix ExTaq（2×）12.5 μL；ROX Reference Dye II（2×）0.25 μL；上、下游引物（10 μmol·L-1）各 1 μL；探針(10 μmol·L-1)1 μL；DNA 模板4 μL，用無菌水補(bǔ)至總體系為25 μL。每個(gè)樣品設(shè)4 次重復(fù)，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)及結(jié)果分析在ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，45個(gè)循環(huán)。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)室送檢玉米蛋白粉樣品轉(zhuǎn)基因成分檢測 采用改良SDS-CTAB 提取方法對實(shí)驗(yàn)室送檢的12 批次玉米蛋白粉樣品提取DNA。利用實(shí)時(shí)熒光PCR 方法對樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，考慮到外源啟動子、終止子容易污染的問題，直接擴(kuò)增內(nèi)源zSSIIb基因和MON810 品系特異性基因，擴(kuò)增體系和程序同1.3.3；同時(shí)設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法結(jié)果比較

分別用市售試劑盒法、CTAB 法和改良SDS-CTAB 法對玉米蛋白干粉進(jìn)行DNA 提取并用核酸蛋白分析儀進(jìn)行DNA 含量的測定。如表2和圖1 所示，類似玉米蛋白粉這種深加工的飼料產(chǎn)品,采用一般提取方法提取的DNA 含量很低[5]，市售7 種試劑盒方法和普通CTAB 法A260/A280、A260/A230比值比較發(fā)現(xiàn)，均存在嚴(yán)重的蛋白質(zhì)污染，這基本符合樣本本身蛋白質(zhì)為主要成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但從DNA 濃度和純度分析發(fā)現(xiàn)，試劑盒法和CTAB 法均無法滿足轉(zhuǎn)基因檢測的需要，后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光PCR 實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這點(diǎn)，內(nèi)源基因zSSIIb Ct值最小為35.23，無法滿足日常轉(zhuǎn)基因檢測需要[6]。在同樣樣品量，均用80 μL 雙蒸水溶解DNA 的前提下，本研究采用改良SDS-CTAB 法獲得的DNA 濃度和純度均比較理想，蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)含量較少。改良SDS-CTAB 法內(nèi)源基因zSSIIb Ct值為28.14，較CTAB 法降低了27%，說明改良SDS-CTAB法在提取玉米蛋白粉DNA質(zhì)量方面具有明顯優(yōu)勢。

圖1 3種方法提取玉米蛋白粉DNA使用zSSIIb基因擴(kuò)增曲線Fig 1 Amplification of zSSIIb gene for corn gluten meal DNA extracted by three methods

表2 3種方法提取玉米蛋白粉DNA的濃度和純度以及zSSIIb 基因擴(kuò)增結(jié)果Table 2 DNA concentration and purity and amplification of zSSIIb gene for corn gluten meal DNA extracted by three methods

2.2 實(shí)驗(yàn)室送檢玉米蛋白粉樣本檢測結(jié)果

利用建立的改良SDS-CTAB 法提取7 批次實(shí)驗(yàn)室送檢玉米蛋白粉樣品中DNA 成分，并對其玉米內(nèi)源基因zSSIIb、外源MON810品系特異性基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖2 和表3。結(jié)果表明：7 批送檢玉米蛋白粉樣品均可檢出玉米內(nèi)源基因zSSIIb，Ct值均在29～31之間，其中2批次玉米蛋白粉樣品種可檢出外源MON810品系特異性基因，Ct值在35 左右，重復(fù)驗(yàn)證后結(jié)果一致，說明2 批次樣品含有轉(zhuǎn)基因玉米成分，同時(shí)表明建立的改良SDS-CTAB 法可有效用于日常轉(zhuǎn)基因檢測。

表3 SDS-CTAB法提取玉米蛋白粉DNA 使用MON810檢測結(jié)果Table 3 Detection for MON810 for corn gluten meal DNA extracted by SDS-CTAB methods

圖2 改良SDS-CTAB提取玉米蛋白粉DNA使用MON810擴(kuò)增曲線Fig 2 Amplification of MON810 for corn gluten meal DNA extracted by modified SDS-CTAB methods

3 討論

隨著基因工程技術(shù)的高速發(fā)展，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的數(shù)量和種類不斷增加。飼料中成分復(fù)雜,包含了當(dāng)今主流的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。與單一植物轉(zhuǎn)基因成分檢測相比，對飼料轉(zhuǎn)基因成分的檢測難度更大[7]。玉米蛋白粉是由玉米籽粒經(jīng)過一系列物理或化學(xué)試劑處理后加工而成的深加工植物產(chǎn)品，在這些加工過程中DNA 受到不同程度的破壞[8]，同時(shí)玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)成分高達(dá)60%以上，進(jìn)而造成了DNA 提取過程中要面臨核酸濃度極低和嚴(yán)重不純兩個(gè)主要問題。本試驗(yàn)采用一般的CTAB 法和市售試劑盒法對玉米蛋白粉樣品進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)提取的DNA 無法滿足下游需要，含量較低且蛋白質(zhì)污染嚴(yán)重；而且，因?yàn)闃悠泛怂岷繕O低，一般的0.1～0.2 g 提取量顯然無法滿足要求，而加大樣品初始量，一般試劑盒法則大多需要合并和反復(fù)富集，時(shí)間有時(shí)會延長到2～3 h?，F(xiàn)有進(jìn)出境產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因檢驗(yàn)中均采用CTAB 法，國內(nèi)外文獻(xiàn)中對SDS-CTAB 法報(bào)道也較少，且多應(yīng)用于植物及微生物DNA 提取中，本研究建立的改良SDS-CTAB 法在國內(nèi)外尚屬首次應(yīng)用于飼料轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中。本研究改良后的SDS-CTAB 法可以充分發(fā)揮SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物釋放核酸以及CTAB 能與核酸形成穩(wěn)定復(fù)合物的雙重特性[9-11]，但是由于采用異丙醇和高濃度鹽沉淀DNA，為了不影響下游實(shí)驗(yàn)，本研究采用差速離心、不同溫度條件等修正措施。此外，PVP 一般用于提取木本植物的DNA，防止植物細(xì)胞中的多酚類物質(zhì)氧化，較少用于草本植物。研究表明，PVP 也具有去除多糖的效果[12-14]，且對下游PCR 實(shí)驗(yàn)有一定的穩(wěn)定促進(jìn)作用[15]，但高濃度PVP 會降低DNA 產(chǎn)出效率，因此最終選擇文中濃度。本研究建立的改良SDS-CTAB 法，可以結(jié)合SDS 和CTAB 自身的優(yōu)勢特點(diǎn)，有效去除蛋白質(zhì)、多糖等污染成分，對下游PCR 抑制較小，可以基本滿足日常進(jìn)出口玉米蛋白粉樣品的轉(zhuǎn)基因檢測，并且大大降低了“假陰性”率，但是耗時(shí)較長，全程8～10 h。在快速通關(guān)的背景下，進(jìn)一步優(yōu)化程序，縮短檢測時(shí)間將是下一步的主要研究重點(diǎn)。