◎ 余宗盛，黎新江，陳小娟，杜玉蘭，李曉敏，栗原博，毛新亮

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

骨關(guān)節(jié)健康養(yǎng)護的功能食品興起于歐美市場，國內(nèi)市場則在近幾年興起。骨關(guān)節(jié)健康重點關(guān)注的是預(yù)防和改善骨性關(guān)節(jié)炎。在中國，雙膝骨關(guān)節(jié)炎患病率達15.6%，并以中老年患者居多，骨性關(guān)節(jié)炎嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。研究表明，骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病與年齡、性別、肥胖、運動損傷、自身免疫以及炎癥代謝等因素密切相關(guān)，主要病理表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)的持續(xù)降解[1]。軟骨基質(zhì)主要包括大分子多糖類物質(zhì)、膠原蛋白、水分以及無機鹽，其中膠原蛋白中以Ⅱ型膠原蛋為主，Ⅱ型膠原蛋白具有維持軟骨組織結(jié)構(gòu)完整性、刺激軟骨細胞生長分化、提升關(guān)節(jié)性能和促進骨形成的作用[2-4]。除抗炎止痛外，補充含膠原蛋白的功能性食品是緩解軟骨流失與促進軟骨再生的重要預(yù)防和改善措施。研究表明，軟骨膠原蛋白肽可與非變性II型膠原蛋白協(xié)同預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎[5]。中藥尤其是藥食兩用的藥材是否對膠原蛋白具有增效作用則鮮有報道。因此，本研究采用地塞米松誘導(dǎo)的斑馬魚軟骨損傷模型，探索姜黃與雪蓮培養(yǎng)物對膠原蛋白保護軟骨組織的協(xié)同增效作用，并采用膠原蛋白和藥食兩用的普通食品原料組合開發(fā)一款功能性食品，為預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎和改善關(guān)節(jié)健康提供一種新途徑，減少藥物治療的成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，日本），顯微鏡相機（VertA1），精密電子天平（CP214，OHAUS，美國），熒光顯微鏡（AZ100，Nikon，日本）。

姜黃（BCW-050 1712/B-11，上海誠一食品），雪蓮培養(yǎng)物（H181001，大連普瑞康生物），非變性II型膠原蛋白（20170902F，海南盛美諾生物），水解II型膠原蛋白（20181125D，海南盛美諾生物），硫酸軟骨素A鈉鹽（6815，上海阿拉丁），乙酸地塞米松（LT80O93，北京百靈威科技），甲基纖維素（Sigma，美國）。

基于本研究制成的完美牌臻固力固體飲料（批次：20 190620；規(guī)格：1 g/袋），完美（廣東）日用品有限公司生產(chǎn)。

1.2 斑馬魚與供試品處理

2日齡的Tg（col2a1a:EGFP）轉(zhuǎn)基因軟骨熒光斑馬魚以自然成對交配繁殖方式獲得，飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中（水質(zhì)：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)率為480～510 μS·cm-1；pH為6.9 ～7.2；硬度為53.7～71.6 mg·L-1CaCO3）。所有飼養(yǎng)管理過程均符合國際AAALAC認證要求。

隨機選取270尾斑馬魚分為正常組、模型組、硫酸軟骨素陽性組（1 000 μg·mL-1）、姜黃組（0.997 μg·mL-1）、雪蓮培養(yǎng)物組（0.997 μg·mL-1）、膠原蛋白組（60.505 μg·mL-1）、膠原蛋白+姜黃組（61.503 μg·mL-1）、膠 原 蛋 白+雪 蓮 培 養(yǎng) 物 組（61.503 μg·mL-1）和膠原蛋白+姜黃+雪蓮培養(yǎng)物組（62.5 μg·mL-1），每孔30尾，置于六孔板中給藥處理。將地塞米松（25 mmol·L-1）與供試品溶于水中處理斑馬魚，每孔為3 mL，正常組給予等體積的養(yǎng)魚用水。于72 h后采用熒光顯微鏡檢測斑馬魚的綠色熒光強度。

1.3 檢測與分析

每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并保存圖片，用NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析，計算熒光強度（S）。軟骨再生作用計算為軟骨再生率=(S供試品組-S模型組)/S模型組×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中兩組間比較采用t-test檢驗，多組間比較采用oneway ANOVE方差分析（方差齊時）或Dunnett’st-檢驗（方差不齊時），p＜0.05表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立與陽性藥硫酸軟骨素對軟骨再生的影響

如圖1與表1所示，與正常對照組相比，地塞米松組斑馬魚軟骨的熒光強度顯著降低（p＜0.001），表明模型建立成功。而陽性對照藥硫酸軟骨素（1 000 μg·mL-1）顯著增強了地塞米松處理后軟骨的熒光強度（p＜0.001），其軟骨再生率為66%。由此可見，硫酸軟骨素對斑馬魚軟骨再生具有明顯的促進作用。

2.2 姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、膠原蛋白對損傷軟骨再生的影響

相較于模型組，姜黃（0.997 μg·mL-1）、雪蓮培養(yǎng)物（0.997 μg·mL-1）、膠原蛋白（60.505 μg·mL-1）均能不同程度地增強軟骨的熒光強度（圖1與表1）。姜黃對軟骨的促進作用較弱，無顯著性差異（p＞0.05）。而雪蓮培養(yǎng)物與膠原蛋白顯著促進了軟骨的修復(fù)（p＜0.001），軟骨再生率分別為48%和73%（表1）。表明姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、膠原蛋白對損傷軟骨再生均有促進作用，且膠原蛋白＞雪蓮培養(yǎng)物＞姜黃。

2.3 姜黃、雪蓮培養(yǎng)物和膠原蛋白復(fù)配對損傷軟骨再生促進的影響

姜黃與雪蓮培養(yǎng)物分別與膠原蛋白進行復(fù)配時（61.503 μg·mL-1），對膠原蛋白的軟骨保護作用產(chǎn)生了一定的拮抗作用，使其軟骨再生率從73%下降為63%和64%。而姜黃、雪蓮培養(yǎng)物與膠原蛋白三者復(fù)配物（62.500 μg·mL-1）的軟骨再生率卻提升至82%（表1）。由此可見，單獨使用姜黃或雪蓮培養(yǎng)物復(fù)配膠原蛋白時，會使膠原蛋白促進損傷軟骨再生效果下降，發(fā)生拮抗作用；而兩者同時復(fù)配可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，增強膠原蛋白的功效。

表1 各組斑馬魚的軟骨EGFP熒光強度與軟骨再生率表

3 功能性食品改善膝骨關(guān)節(jié)炎的有效率研究

基于本研究開發(fā)了一款功能性食品——完美牌臻固力固體飲料，現(xiàn)就其改善膝骨關(guān)節(jié)炎的有效率進行調(diào)查。以填寫《膝骨性關(guān)節(jié)炎程度調(diào)查問卷》的方式征集人群，同時采用年齡≥50歲，晨僵時間≤30 min，活動時有骨摩擦音，X線片顯示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和（或）囊性變、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成4項標準要求綜合選定食用完美牌臻固力固體飲料的對象，共計32人。其中6人完全符合4項標準，19人滿足其中1項標準，7人屬于《膝骨性關(guān)節(jié)炎程度調(diào)查問卷》中關(guān)節(jié)癥狀評分排名前7位的人員。

食用完美牌臻固力固體飲料1個月后，有效樣本25人。參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，根據(jù)試用前后癥狀積分下降百分率進行功能評價判斷，功能效果分為顯效（癥狀積分減少≥70%）、有效（30%≤癥狀積分減少＜70%）、無效（癥狀積分減少＜30%）3個等級，計算公式（尼莫地平法）為（試用前總積分-試用結(jié)束后總積分）/試用前總積分×100%，總有效率=（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總試用例數(shù)×100%。

調(diào)查結(jié)果顯示，完美牌臻固力固體飲料試用1個月，按《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》標準，改善膝骨性關(guān)節(jié)炎總有效率為52.0%。

4 結(jié)論

本研究以轉(zhuǎn)基因軟骨熒光斑馬魚為模型，揭示了姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、膠原蛋白組合物對損傷關(guān)節(jié)軟骨再生的促進作用。此外，通過配方實驗發(fā)現(xiàn)姜黃、雪蓮培養(yǎng)物兩種中藥單獨復(fù)配膠原蛋白時會降低其損傷軟骨再生促進作用；姜黃、雪蓮培養(yǎng)物兩者同時和膠原蛋白進行復(fù)配將協(xié)同增效膠原蛋白的軟骨再生功能。斑馬魚作為一種非哺乳類模式生物，具有胚胎透明、骨骼發(fā)育迅速、與人類基因高度同源等特點，在骨研究領(lǐng)域已逐漸成為重要的藥物篩選模型[6]。在功能食品開發(fā)過程中，采用斑馬魚作為骨關(guān)節(jié)軟骨損傷改善作用的篩選模型也已發(fā)揮了重要的作用，篩選了姜黃、雪蓮培養(yǎng)物、非變性II型膠原蛋白、水解II型膠原蛋白重要的組合物并以優(yōu)選的組合比例開發(fā)了預(yù)防和改善膝骨關(guān)節(jié)炎的功能性食品，為后續(xù)功能性食品開發(fā)提供了一條可借鑒的研發(fā)思路。