唐流洋 劉 霞 胡 銳

(重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院神經外科，重慶市 401420)

自發(fā)性腦出血是中老年患者常見的致殘、致死原因，盡管當前醫(yī)療技術明顯提高，但腦出血的病死率仍居高不下，在53%～59%之間[1]。腦出血主要是由于薄弱的腦動脈血管破裂，導致血液外滲，腦實質局部壓力增加，進而發(fā)生腦水腫、氧化應激和炎性反應，對患者造成繼發(fā)性傷害。腦出血最常見于基底節(jié)部，其次是大腦皮層和腦干。研究表明，腦出血與肥胖、高血壓、糖尿病、飲酒等因素密切相關[2]，上述因素可長期刺激血管內皮，導致血管內皮細胞變性、凋亡，最終引起血管破裂，發(fā)生腦出血。一些學者提出腦血管內皮功能紊亂是腦出血的病理基礎[3]。有研究結果顯示，內皮細胞特異性分子-1(endothelial cell specific molecule-1，ESM-1)屬于可溶性硫酸皮膚素蛋白聚糖，是一種與內皮功能紊亂有關的標志物，其參與血管內皮細胞增殖、黏附和遷移，與血管生長因子相互作用，共同維持血管內皮細胞穩(wěn)定[4-5]。Zhu等[6]發(fā)現(xiàn)，ESM-1參與調控人神經膠質瘤的血管生成。內臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor,Vaspin)是一種胰島素增敏劑和抗炎因子，Vaspin可以調控血管內皮炎癥因子表達，能夠對抗細胞凋亡，保護血管內皮[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin通過抑制腎臟核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路，從而減輕腎臟組織的炎癥反應和缺血再灌注損傷，保護血管內皮。本文旨在探討ESM-1、Vaspin在腦出血患者腦出血點附近腦組織中的表達水平及其與疾病嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年6月至2021年7月在我院神經外科確診為腦出血的84例患者作為研究對象，其中男性46例、女性38例，年齡42～76(59.78±11.60)歲。納入標準：(1)腦出血的診斷符合《中國腦出血診治指南(2014)》[9]中的相關標準，患者均經頭顱CT檢查確診為腦出血且行血腫清除術；(2)均為首次發(fā)病，并且在腦出血后24 h內入院；(3)近期未使用抗生素、免疫抑制劑。排除標準：(1)既往有腦創(chuàng)傷、腦卒中、腦腫瘤等病史的患者；(2)合并精神或其他神經系統(tǒng)疾病的患者；(3)腦血管瘤、腦血管畸形等繼發(fā)性腦出血患者；(4)合并急慢性感染的患者。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集臨床資料：收集患者的性別、年齡、合并基礎疾病(高血壓、糖尿病、高脂血癥)情況；入院時采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)對患者病情嚴重程度進行評估[10]；通過頭顱影像學評估腦出血情況，并采用多田公式計算腦出血量[11]；出院后隨訪3個月，采用格拉斯哥預后量表(Glasgow Outcome Scale，GOS)評分[12]評估患者預后情況。

1.2.2 組織標本收集：所有患者均接受血腫清除手術治療。術中選取手術通路中鄰近血腫0.5 cm以內的腦組織碎塊0.3 g作為腦出血組，取同一腦出血患者距出血邊緣>2 cm的腦組織碎塊0.3 g作為對照組，將收集到的樣本先速凍于液氮中，隨后貯存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2.3 免疫組化法檢測ESM-1和Vaspin的蛋白表達情況：將術中獲取的部分腦組織制作成5 μm厚度的切片，58 ℃恒溫烘烤2 h，依次使用二甲苯、酒精、3%過氧化氫溶液處理標本，然后檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)進行抗原修復；分別滴加抗ESM-1抗體或Vaspin抗體(稀釋比例為1∶100；北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-3615R、bs-7536P)100 μL，4 ℃下孵育過夜，PBS洗片，然后滴加生物素化山羊抗兔IgG(無須稀釋；北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：PV-6000)100 μL，37 ℃孵育30 min，隨后使用PBS溶液清洗干凈后，DAB染色2 min，蘇木精復染1 min，乙醇脫水，玻璃片固定。

在電子顯微鏡下隨機選擇5個視野檢查ESM-1及Vaspin的蛋白表達情況。如細胞質和/或細胞核呈棕黃色顆粒，則判定為陽性細胞。由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法對切片染色結果進行觀察和評估，如有差異，則重新評估建立最終評分。具體評估標準見下表1，以著色程度計分與陽性細胞百分比計分相乘所得總計分來判定表達情況，將>4分定義為陽性表達。

表1 染色評估標準

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測ESM-1和Vaspin的mRNA表達量：將剩下的腦組織樣本使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific公司，貨號：K0731)提取RNA，根據M-MLV反轉錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，貨號：R1042]進行反轉錄；然后使用熒光定量染料(北京索萊寶科技有限公司，貨號：SR1110)配制反應體系，反應體系包括cDNA 5 μL、反應預混液12.5 μL、正向引物(10 μmol/L)0.5 μL、反向引物(10 μmol/L)0.5 μL、去離子水6.5 μL。在ExicyclerTM96(BIONEER公司)定量系統(tǒng)上采集信號，擴增程序為預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 30 s，變性—退火/延伸共40個循環(huán)。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算ESM-1和Vaspin的mRNA相對表達量。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表2。

表2 引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數資料采用例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；相關性分析采用Pearson檢驗；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線繪制腦出血組織中ESM-1 mRNA與Vaspin mRNA表達量對腦出血患者預后的預測效能，其中曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.70～0.85時預測價值一般，>0.85時預測價值較好，AUC的比較采用Z檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腦出血患者腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率及ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表達量的比較 對照組腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率，以及ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表達量均高于腦出血組(均P<0.05)。見表3、圖1、圖2。

表3 腦出血患者腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率及mRNA相對表達量的比較

圖1 ESM-1蛋白在腦組織中的陽性表達(免疫組化染色，×100)

圖2 Vaspin蛋白在腦組織中的陽性表達(免疫組化染色，×100)

2.2 不同病情嚴重程度患者腦出血點附近腦組織ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率的比較 按入院時NIHSS評分將患者分為輕型組33例(NIHSS評分1～4分)、中型組26例(NIHSS評分5～15分)、重型組25例(NIHSS評分>15分)。3組患者的性別、年齡、合并基礎疾病情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而輕型組腦出血點附近腦組織中的ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率均高于重型組(均P<0.05)。見表4。

表4 不同病情嚴重程度患者一般資料及腦出血點附近腦組織ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率的比較

2.3 不同出血量患者腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率的比較 根據入院時出血量將患者分為小量出血組31例(腦出血量<15 mL)、中量出血組28例(腦出血量15～30 mL)、大量出血組25例(腦出血量>30 mL)。3組患者的性別、年齡、合并基礎疾病情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，而小量出血組腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率均高于大量出血組(均P<0.05)。見表5。

表5 不同出血量患者一般資料及腦出血點附近腦組織ESM-1、Vaspin蛋白陽性表達率的比較

2.4 腦出血患者腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin mRNA表達量的相關性 腦出血患者腦出血點附近腦組織中ESM-1 mRNA表達量與Vaspin mRNA表達量呈正相關(r=0.674，P<0.001)。見圖3。

圖3 腦出血患者腦出血點附近腦組織中ESM-1 mRNA表達量與Vaspin mRNA表達量的相關性

2.5 腦出血點附近腦組織ESM-1 mRNA、Vaspin mRNA表達量對腦出血患者預后的預測效能 所有患者出院后均隨訪3個月，按GOS評分分為預后良好組49例(GOS評分>4分)與預后不良組35例(GOS評分≤4分)。ROC分析結果顯示，腦出血點附近腦組織ESM-1 mRNA表達量預測腦出血患者預后不良的AUC為0.842(95%CI:0.784，0.901)，截斷值、敏感度、特異度分別為1.38、83.30%、72.30%；腦出血點附近腦組織Vaspin mRNA表達量預測腦出血患者預后不良的AUC為0.896(95%CI:0.846，0.946)，截斷值、敏感度、特異度分別為1.46、83.30%、84.30%；ESM-1 mRNA表達量、Vaspin mRNA表達量聯(lián)合預測的AUC為0.947(95%CI:0.914，0.981)，敏感度及特異度分別為91.70%、83.20%。ESM-1 mRNA表達量、Vaspin mRNA表達量單獨預測腦出血患者預后不良的AUC差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.383，P=0.167)，二者聯(lián)合預測腦出血患者預后不良的AUC大于ESM-1 mRNA表達量(Z=3.045，P=0.002)，但與Vaspin mRNA表達量相比差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.687，P=0.092)。見圖4。

圖4 腦出血點附近腦組織ESM-1 mRNA表達量、Vaspin mRNA表達量預測腦出血患者預后不良的ROC曲線

3 討 論

腦出血好發(fā)于秋冬季節(jié)，與患者情緒波動有關，具有發(fā)病急、進展快、預后差等特點，因此，早期判斷病情嚴重程度和疾病轉歸，將有助于提高治療效果。研究表明，自發(fā)性腦出血的主要原因為高血壓，高血壓產生的機械應變力引起血管壁損傷，進而破壞血管內皮細胞以形成顱內微小血管瘤[13]。Kang等[14]通過小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，內皮酶對損傷后血管修復過程具有重要作用，提示其可能是血管內皮細胞修復的潛在靶點。目前關于腦血管自我修復的潛在靶點的研究較少，本研究觀察了正常腦組織與腦出血點附近腦組織中ESM-1、Vaspin的表達情況，為腦血管自我修復提供新靶點。

ESM-1是一種免疫炎癥標志物，與腦血管疾病相關，在調節(jié)血管內皮黏附中發(fā)揮重要作用，在血漿中能夠維持內皮細胞的完整功能[15]。ESM-1還可以通過激活氧自由基，誘導神經系統(tǒng)氧化應激反應，進而影響神經細胞的能量代謝。同時，ESM-1也是內皮細胞中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號的調節(jié)因子，這可能對腦出血血管修復具有潛在的治療價值[16]。本研究結果顯示，對照組ESM-1蛋白陽性表達率及mRNA表達量均高于腦出血組，且輕型組、小量出血組腦出血點附近腦組織中的ESM-1蛋白陽性表達率分別高于重型組、大量出血組(均P<0.05)，說明腦出血點附近腦組織中ESM-1呈低表達水平，且ESM-1可以反映腦出血患者病情嚴重程度，這可能提示血管內皮自我修復能力降低。既往研究顯示，缺氧誘導因子-1α/VEGF通路可調控ESM-1從而增強單核細胞對血管內皮細胞的黏附作用，高水平的ESM-1對血管損傷有修復作用，而ESM-1水平較低則不利于血管修復[16-17]，與本研究結論相似。此外，本研究結果顯示，腦出血點附近腦組織的ESM-1 mRNA表達量預測腦出血患者預后不良的AUC為0.842，說明ESM-1對腦出血患者預后有一定預測價值。以上研究結果均提示ESM-1在腦出血中扮演重要角色，ESM-1可能成為治療急性腦出血的新靶點。

Vaspin是一種抗炎因子，主要參與脂質代謝和胰島素抵抗過程。在血管內皮中，Vaspin可以降低血管內皮功能障礙，通過抑制炎癥反應保護血管內皮[18]。高榮華等[19]研究發(fā)現(xiàn)，當血清Vaspin水平低于0.57 ng/mL時，提示急性心肌梗死患者冠狀動脈支架植入術后發(fā)生心血管不良事件風險較大，表明低表達量的Vaspin與急性心肌梗死患者機體的炎癥反應增強相關。本研究結果顯示，對照組Vaspin蛋白陽性表達率及mRNA表達量均高于腦出血組，且輕型組、小量出血組腦出血點附近腦組織中的Vaspin蛋白陽性表達率分別高于重型組、大量出血組(均P<0.05)，說明Vaspin可能參與腦出血的形成過程，其表達水平與腦出血患者病情嚴重程度有關。原因可能是：Vaspin表達量越低，對血管修復作用越弱，患者病情越嚴重，血管壁及腦組織破壞越嚴重。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Vaspin可以增強內皮細胞與細胞外基質的黏附，增加血管黏附力和抗剪切力。本研究結果顯示，腦出血點附近腦組織的Vaspin mRNA表達量預測腦出血患者預后不良的AUC為0.896，敏感度為83.30%，特異度84.30%，說明Vaspin對腦出血患者預后有一定預測價值。此外，本研究相關分析結果顯示，腦出血點附近腦組織的ESM-1 mRNA與Vaspin mRNA表達量呈正相關，我們推測ESM-1與Vaspin共同維持血管內皮細胞完整性。ESM-1 mRNA表達量、Vaspin mRNA表達量聯(lián)合預測腦出血患者預后的AUC為0.947，敏感度、特異度為91.70%、83.20%，提示ESM-1、Vaspin聯(lián)合預測腦出血患者預后具有較大的參考價值。

綜上所述，ESM-1、Vaspin在腦出血患者腦出血點附近腦組織中呈低表達，二者共同參與腦出血的發(fā)生，且與腦出血嚴重程度密切相關，二者聯(lián)合預測腦出血患者預后的價值較高。