夏 晨 汪受傳 李 萌 魏肖云

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是由于變應(yīng)原刺激特應(yīng)性個(gè)體，導(dǎo)致鼻黏膜產(chǎn)生IgE，進(jìn)而使得各種免疫細(xì)胞共同作用的I 型變態(tài)反應(yīng)，屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)中“鼻鼽”范疇。近年來(lái)，AR 患病率逐漸增加。目前西醫(yī)多使用鼻用糖皮質(zhì)激素、第二代抗組胺藥等來(lái)控制AR癥狀，但停藥后癥狀容易復(fù)發(fā)；而中藥治療既可減輕AR癥狀，還能改善機(jī)體免疫功能，受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。汪受傳教授從“伏風(fēng)”論治，自擬消風(fēng)宣竅湯治療小兒鼻鼽，臨床效果好，不良反應(yīng)少，有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1]。前期研究已經(jīng)證實(shí)，消風(fēng)宣竅湯治療兒童AR的作用機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)以AR 模型豚鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)一步探究其免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40 只Hartley 豚鼠，體重（300±35）g，清潔級(jí)，4～5 w齡，雄性，來(lái)源于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（蘇）（2012-0008）。

1.2 藥品與試劑（1）消風(fēng)宣竅湯（由炙麻黃3 g、桂枝3 g、辛夷3 g、蒼耳子6 g、五味子6 g、烏梅6 g、膽南星6 g、廣地龍6 g組成)，來(lái)源于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房制成濃縮濾液，生藥含量為1.05 g/mL；（2）氯雷他定來(lái)源于上海先靈葆雅制藥有限公司（批號(hào)為10KRXF1047），規(guī)格為10 mg/片，用蒸餾水稀釋為0.1 g/mL；（3）卵白蛋白（OVA)來(lái)源于美國(guó)Sigma 公司（批號(hào)為326A05）；（4）氫氧化鋁凝膠來(lái)源于上海美興化工有限公司（批號(hào)為2008050）；（5）酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測(cè)試劑盒來(lái)源于美國(guó)R＆D 公司（批號(hào)為201304）。

1.3 儀器與設(shè)備DMIL 型倒置顯微鏡來(lái)源于德國(guó)Leica 公司；EXL 800 型酶標(biāo)儀來(lái)源于美國(guó)BioTek公司。

1.4 分組、建模及給藥40只Hartley 豚鼠被隨機(jī)分成正常組、模型組、消風(fēng)宣竅湯組、氯雷他定組，每組10 只。在正式試驗(yàn)之前，將每只豚鼠鼻腔分泌物行Wright染色，觀察嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的分布情況，發(fā)現(xiàn)染色結(jié)果均為陰性。除正常組外，其余3 組采用OVA 模型的建立方法[3]制備豚鼠變應(yīng)性鼻炎模型，并用鼻部分泌物EOS分布情況、鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分評(píng)估造模成功與否（局部致敏30 min，若鼻腔分泌物涂片EOS 陽(yáng)性且鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分總分>5 分，表示AR 豚鼠模型構(gòu)建成功）。待造模成功，按照1歲兒童臨床等效劑量并根據(jù)《藥理試驗(yàn)方法學(xué)》公式進(jìn)行人和動(dòng)物給藥劑量的換算，消風(fēng)宣竅湯組等效劑量為14 g/（kg·d），氯雷他定組等效劑量為1.88 mg/（kg·d）。給藥方式為消風(fēng)宣竅湯組、氯雷他定組每只豚鼠每8 h灌胃1次，每日2次；AR模型組、正常組則按照相同次數(shù)、方法給予相等量的生理鹽水。共灌胃7 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 鼻部行為學(xué)觀察 給藥7 d 后，對(duì)豚鼠給予致敏物，給致敏物即開(kāi)始計(jì)時(shí)，共計(jì)時(shí)30 min，觀察各組豚鼠鼻部癥狀、行為，根據(jù)過(guò)敏反應(yīng)行為的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[3]：噴嚏次數(shù)1～3 次為1 分，4～10 次為2 分，≥11次為3分；擦鼻次數(shù)1～4次為1分，4次以上為4分；清涕流至前鼻孔為1 分，超出前鼻孔為2 分，涕流滿面為3分。

1.5.2 鼻黏膜分泌物陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 鼻部行為學(xué)觀察后，將每只豚鼠鼻腔分泌物涂片滴加Wright 染色液，油鏡下每張涂片觀察10 個(gè)視野(視野倍數(shù)：10×40)，分別計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)和肥大細(xì)胞(MC)的比率。

1.5.3 免疫指標(biāo) 鼻黏膜分泌物涂片后，麻醉豚鼠，采頸動(dòng)脈血5 mL，以3000 r/min離心10 min，分離出血清，并于-70 ℃冰箱保存。用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別檢測(cè)四組豚鼠的血清IgE、組胺及Th1、Th2、Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平。

1.5.4 病理指標(biāo) 豚鼠取血后處死，取出其鼻腔黏膜組織，在4%多聚甲醛溶液中固定72 h，依次經(jīng)過(guò)75%-85%-95%-100%梯度酒精脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋。以4～5 μm切片，最后行HE染色，觀察高倍鏡下各組豚鼠的鼻黏膜組織學(xué)改變情況，并進(jìn)行病理變化分級(jí)評(píng)分[3]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠死亡情況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共死亡10 只豚鼠。正常組不明原因死亡1只；模型組因鼻塞嚴(yán)重死亡2只；消風(fēng)宣竅湯組因鼻塞死亡1只；氯雷他定組因鼻塞死亡1 只、不明原因死亡1 只。治療結(jié)束后各組豚鼠數(shù)量如下：正常組9 只，模型組8 只，消風(fēng)宣竅湯組9只，氯雷他定組8只。經(jīng)比較，各組豚鼠死亡數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組豚鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分比較模型組的各項(xiàng)癥狀及癥狀積分明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，消風(fēng)宣竅湯組與氯雷他定組的各項(xiàng)癥狀及癥狀積分均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而消風(fēng)宣竅湯組與氯雷他定組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組豚鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分比較（分，）

表1 各組豚鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分比較（分，）

注：與正常組相比，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 各組豚鼠鼻黏膜分泌物陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較和正常組比較，模型組豚鼠鼻腔分泌物中EOS、MC計(jì)數(shù)均有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和模型組比較，消風(fēng)宣竅湯組和氯雷他定組兩種陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而消風(fēng)宣竅湯組與氯雷他定組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組豚鼠鼻黏膜分泌物EOS、MC計(jì)數(shù)比較（）

表2 各組豚鼠鼻黏膜分泌物EOS、MC計(jì)數(shù)比較（）

注：和正常組相比，aP<0.05；和模型組比較，bP<0.05

2.4 各組豚鼠血清IgE、組胺水平比較模型組豚鼠血清IgE、組胺水平較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。和模型組相比，消風(fēng)宣竅湯組與氯雷他定組豚鼠血清IgE、組胺水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；消風(fēng)宣竅湯組較氯雷他定組下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組豚鼠血清IgE、組胺水平比較（）

表3 各組豚鼠血清IgE、組胺水平比較（）

注：和正常組相比，aP<0.05；和模型組比較，bP<0.05；和氯雷他定組比較，cP<0.05

2.5 各組豚鼠Th1、Th2、Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較與正常組相比，模型組豚鼠血清中的NFκB、IL-4、IL-6、IL-17 水平均明顯升高，IFN-γ、IL-12水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，消風(fēng)宣竅湯組及氯雷他定組豚鼠血清中NFκB、IL-4、IL-6、IL-17 水平均顯著降低，IFN-γ、IL-12水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。消風(fēng)宣竅湯組與氯雷他定組各細(xì)胞因子水平相比，差異無(wú)統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組豚鼠血清中Th17、Th1、Th2 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（）

表4 各組豚鼠血清中Th17、Th1、Th2 細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（）

注：和正常組相比，aP<0.05；和模型組比較，bP<0.05

2.6 各組豚鼠病理組織評(píng)分比較正常組的豚鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)基本正常，HE 染色未見(jiàn)EOS。模型組鼻黏膜組織上皮細(xì)胞壞死脫落或化生，固有層組織水腫，大量EOS浸潤(rùn)，腺體增生明顯，病理組織評(píng)分明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。消風(fēng)宣竅湯與氯雷他定組的上述病理學(xué)改變均有所減輕，鼻黏膜組織炎性反應(yīng)明顯減輕，黏膜血管輕度擴(kuò)張，稍有水腫，病理組織評(píng)分明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。消風(fēng)宣竅湯組與氯雷他定組的病理組織評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組豚鼠鼻黏膜病理組織評(píng)分比較（分，）

表5 各組豚鼠鼻黏膜病理組織評(píng)分比較（分，）

注：和正常組相比，aP<0.05；和模型組比較，bP<0.05

3 討論

AR 已經(jīng)成為兒童主要呼吸道慢性炎癥性疾病，有報(bào)道[4]顯示2016 年美國(guó)兒童變應(yīng)性鼻炎的自報(bào)患病率達(dá)到40%，確診患病率為13%。2020年內(nèi)蒙古12個(gè)市6～18歲兒童青少年變應(yīng)性鼻炎的標(biāo)化自報(bào)患病率為18.20%，標(biāo)化確診患病率為9.71%[5]。盡管有很多治療AR 的西藥，如抗組胺藥、鼻用糖皮質(zhì)激素、鼻減充血?jiǎng)┖头蚀蠹?xì)胞穩(wěn)定劑等，但長(zhǎng)期治療的不良反應(yīng)多，復(fù)發(fā)率高。因此，對(duì)改善過(guò)敏癥狀的新方法或替代方法的需求日益增加。臨床研究顯示消風(fēng)宣竅湯不僅可治療患兒變應(yīng)性鼻炎發(fā)作癥狀，而且可以逐步改善患兒過(guò)敏體質(zhì)，減少鼻鼽反復(fù)發(fā)作，長(zhǎng)期應(yīng)用不良反應(yīng)少[6]，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究初步探討了消風(fēng)宣竅湯治療AR的免疫作用機(jī)制。

AR 是以IgE 明顯升高為特征的I 型變態(tài)反應(yīng)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，重要原因之一為T(mén)h1/Th2 平衡失調(diào)。糾正Th1/Th2細(xì)胞的分化、Th1/Th2細(xì)胞因子分泌的失衡，可有效抑制變應(yīng)性炎癥反應(yīng)。IL-4為T(mén)h2細(xì)胞重要的特征因子之一，可以誘導(dǎo)免疫球蛋白IgM至IgE 的同型轉(zhuǎn)換，使得MC 的脫顆粒作用增強(qiáng)。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析表明，AR感染后血清IL-4水平與其SFAR、VAS 評(píng)分以及外周血清IgE 均呈正相關(guān)[7]。IFN-γ 能激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)靜止的Th0 細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化，還能抑制Th2 細(xì)胞的增殖[8]。IL-4 和IFN-γ 的表達(dá)異常提示Th 細(xì)胞的分化偏移。IL-4 逐漸增多和IFN-γ 減少，乃是變應(yīng)性鼻炎機(jī)體內(nèi)IgE 合成增多的主要機(jī)制，INF-γ 在AR 炎癥早期發(fā)生可能起主導(dǎo)作用，而IL-4在晚期發(fā)展可能發(fā)揮主要作用[9]。IL-6是Th2細(xì)胞分泌的另一種重要的細(xì)胞因子，參與多種靶細(xì)胞黏附和集聚，并具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，可提示氣道炎癥的活躍程度，促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)生和氣道結(jié)構(gòu)重建。研究證實(shí)IL-6 在CRS 的鼻腔黏膜高表達(dá)[10]。IL-12 是誘導(dǎo)Th0 向Th1 細(xì)胞分化的重要因素，可促進(jìn)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，并抑制Th2型細(xì)胞因子，還可以通過(guò)抑制IL-4發(fā)育從而拮抗Th2型細(xì)胞應(yīng)答。IL-12為誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的最主要的細(xì)胞因子[11]。當(dāng)血清IL-12過(guò)高表達(dá)時(shí)，EOS分化、生成得到抑制，使進(jìn)入靶組織的EOS 和T 細(xì)胞減少，進(jìn)一步抑制由IgE 介導(dǎo)的I 型變態(tài)反應(yīng)，改善AR 癥狀[12]。NFκB參與炎癥和免疫反應(yīng)，并起樞紐作用，可調(diào)節(jié)各類(lèi)炎癥遞質(zhì)和免疫因子之間的級(jí)聯(lián)放大連鎖效應(yīng)，因此抑制其激活可有效防止AR的產(chǎn)生[13]。NF-κB表達(dá)增加，可誘發(fā)Th2 細(xì)胞因子IL-4 等分泌，從而促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞合成IgE，同時(shí)增強(qiáng)EOS 的黏附聚集[14]。Th17細(xì)胞可上調(diào)Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性氣道炎癥，IL-17是其分泌的特征性細(xì)胞因子，可增強(qiáng)氣道平滑肌收縮和氣道上皮細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原的通透性[15]。IL-17可增加氣道上皮細(xì)胞黏液的表達(dá)，并通過(guò)NF-κB依賴通路激活黏液蛋白基因表達(dá)和蛋白生成[16]。炎癥性疾病和自身免疫性疾病發(fā)生可能與IL-17過(guò)度產(chǎn)生有關(guān)。

本研究顯示，消風(fēng)宣竅湯治療后可減輕豚鼠流涕、擦鼻、噴嚏等AR 癥狀，顯著減少鼻腔分泌物中EOS和MC計(jì)數(shù)，降低血清中IgE、組胺水平，證實(shí)了消風(fēng)宣竅湯可以減輕局部免疫反應(yīng)，起到抗炎、抗過(guò)敏的作用，并可以改善鼻黏膜的病理?yè)p傷。其中消風(fēng)宣竅湯治療后豚鼠血清IgE、組胺水平下降較氯雷他定組更為明顯，提示消風(fēng)宣竅湯抗過(guò)敏方面可能更有優(yōu)勢(shì)。AR感染前，各細(xì)胞因子之間相互聯(lián)系、協(xié)調(diào)及作用，Th1 和Th2 則通過(guò)這些細(xì)胞因子的變化保持著動(dòng)態(tài)平衡。臨床證實(shí)AR感染后，存在Th1/Th2平衡被破壞及Th17 細(xì)胞比例升高的情況[17]。本研究通過(guò)豚鼠感染前后細(xì)胞因子情況的對(duì)比，得到了類(lèi)似的結(jié)論，并通過(guò)觀察Th17、Th1、Th2細(xì)胞分泌的不同細(xì)胞因子的水平變化，證實(shí)消風(fēng)宣竅湯治療后可以降低豚鼠血清Th2 相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-6 含量，增高Th1 分泌IFN-γ、IL-12 相關(guān)細(xì)胞因子的含量，同時(shí)抑制了血清NF-κB、Il-17 表達(dá)，其細(xì)胞因子的水平變化較氯雷他定組無(wú)顯著差異。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)研究，推測(cè)消風(fēng)宣竅湯治療變應(yīng)性鼻炎模型可能通過(guò)降低機(jī)體Th2 相關(guān)細(xì)胞因子含量，同時(shí)升高Th1 相關(guān)細(xì)胞因子含量，來(lái)抑制Th2 免疫反應(yīng)，增強(qiáng)Th1 的免疫反應(yīng)，糾正Th1/Th2 免疫失衡來(lái)治療疾病，也提示調(diào)節(jié)機(jī)體中Th1/Th2、IL-17 免疫平衡狀態(tài)成為該疾病新的治療方向[18]。