李 莉, 李 碩, 王海燕, 孫 磊

(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

為避免化妝品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和使用的過程中受到微生物污染,延長(zhǎng)產(chǎn)品保存期限和保障消費(fèi)者使用安全,生產(chǎn)廠家通常在化妝品配方中添加一種或多種防腐劑[1]。目前化妝品準(zhǔn)用防腐劑共有51種,《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》僅對(duì)單一物質(zhì)的最大允許使用量進(jìn)行了限定,但未對(duì)單一化妝品中可以使用的防腐劑種類數(shù)量做出規(guī)定,也未對(duì)產(chǎn)品中多種防腐劑混合使用的最大使用量進(jìn)行限定。市售化妝品中多種防腐劑配合使用的情況較為普遍,加入多種防腐劑不但可以擴(kuò)大抗菌廣譜性,起到較好的抑菌作用,同時(shí)還可以降低每種防腐劑的用量,避免超出限量[2]。防腐劑需要達(dá)到一定的使用濃度才能發(fā)揮其抑菌的功效,因此添加量一般在千分比到百分比的級(jí)別[2,3]。

目前,化妝品中防腐劑的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[3-7]。高效液相色譜法靈敏、高效,選擇性強(qiáng),而且51種準(zhǔn)用防腐劑中大部分組分都能用該法分析,所以該技術(shù)已經(jīng)成為應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法。色譜柱是高效液相分離系統(tǒng)中最重要的環(huán)節(jié),色譜柱的類型決定色譜系統(tǒng)的性質(zhì),色譜柱的粒徑和長(zhǎng)度影響分析時(shí)間和分析效率[8],采用不同品牌、不同型號(hào)的色譜柱分析具體樣品時(shí),由于色譜柱硅膠純度、鍵合工藝和封尾技術(shù)等工藝方面的不同造成選擇性差異較大,溶質(zhì)的保留值、色譜峰之間的分離度甚至色譜峰順序都可能出現(xiàn)較大的差異[9-11]。特別是當(dāng)樣品基質(zhì)中含堿性或弱酸性化合物時(shí)這種風(fēng)險(xiǎn)更為顯著[9]。如果使用的色譜柱不合適，目標(biāo)物色譜峰和干擾峰之間分離度則達(dá)不到要求，從而影響定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,在實(shí)際檢驗(yàn)工作中,尤其是進(jìn)行高效液相色譜法分析時(shí),色譜柱的選擇是一項(xiàng)十分重要且困難的工作,關(guān)系到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗[12]。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》理化檢驗(yàn)方法在描述高效液相色譜方法時(shí),通常僅列出色譜柱的填料種類、孔徑、顆粒大小等基本信息,如“C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)或等效色譜柱”,為了避免商業(yè)競(jìng)爭(zhēng),在非必要條件下一般不予公開方法使用的色譜柱品牌、型號(hào)等具體信息。雖然這樣做的初衷是為了體現(xiàn)方法的公平性,但也在一定程度上增加了檢驗(yàn)方法實(shí)際執(zhí)行的難度,特別是多種組分同時(shí)分析時(shí),色譜柱的選擇存在一定的盲目性。

自20世紀(jì)70年代開始,國(guó)內(nèi)外不少研究人員開始研究影響色譜柱選擇性的因素,嘗試建立量化表征方法,用于比較不同品牌型號(hào)色譜柱的選擇性差異。根據(jù)色譜柱填料的不同將C18色譜柱分為3類[13]: A型色譜柱(早期開發(fā)的色譜柱,硅膠純度較低,硅羥基和金屬殘留較高)、B型色譜柱(新型色譜柱,硅膠純度較高,金屬殘留量低,是目前市場(chǎng)上主流色譜柱)、E型色譜柱(C18鏈內(nèi)嵌極性基團(tuán)或極性基團(tuán)封尾的色譜柱)。但這種分類模式比較籠統(tǒng),與色譜柱的選擇性缺乏關(guān)聯(lián),難以表征色譜柱選擇性的差異[10]。21世紀(jì)初,研究者通過采用不同的色譜柱參數(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,逐漸建立色譜選擇性的柱表征體系[10,11]。目前比較有影響力的色譜柱數(shù)據(jù)庫(kù)包括[9]: USP(United States Pharmacopeia)、PQRI(Product Quality Research Institute)、KUL(Katholieke Universiteit Leuven)和ACD(Advanced Chemistry Development)數(shù)據(jù)庫(kù),每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)都包含了數(shù)百種色譜柱信息,但以上4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均未收載國(guó)產(chǎn)色譜柱的信息?；瘖y品種類繁多，成分復(fù)雜,如何對(duì)多組分進(jìn)行有效分離一直是化妝品分析檢測(cè)的難點(diǎn),本研究以《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》收載的23種防腐劑的測(cè)定方法為例,探討色譜柱對(duì)高效液相色譜分析結(jié)果的影響,并結(jié)合現(xiàn)有的色譜柱研究成果和評(píng)價(jià)手段,嘗試對(duì)不同色譜柱針對(duì)化妝品23種防腐劑的選擇性及等效性進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè),以期為化妝品理化檢驗(yàn)中該類難題的解決提供研究思路和數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters e2695高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測(cè)器,美國(guó)Agilent公司;XP205電子天平,瑞士Mettler-Toledo公司。C18色譜柱規(guī)格、型號(hào)、廠家等參數(shù)見表1。

23種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品及其純度信息見表2。甲醇、乙腈、二甲亞砜均為色譜純,購(gòu)自德國(guó)Merck公司;磷酸為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

參照《國(guó)家藥監(jiān)局關(guān)于將化妝品中防腐劑檢驗(yàn)方法等7項(xiàng)檢驗(yàn)方法納入化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015年版)的通告》(2021年第17號(hào))新發(fā)布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第4章4.1節(jié)甲基異噻唑啉酮等23個(gè)組分的檢驗(yàn)方法(該方法以下簡(jiǎn)稱為“規(guī)范方法”)對(duì)化妝品中23種防腐劑進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取23種標(biāo)準(zhǔn)品適量(精確至0.000 01 g),置于同一容量瓶中,先用2 mL二甲亞砜溶解,再用乙腈定容至刻度,搖勻,置于4 ℃冰箱中冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,用甲醇稀釋得混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2液相色譜分析條件

色譜柱:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相A:磷酸水溶液(量取磷酸1.2 mL,加水至1 000 mL,混勻);流動(dòng)相B:乙腈;流速:1.0 mL/min;梯度洗脫程序:0～5 min, 10%B; 5～29 min, 10%B～50%B; 29～41 min, 50%B ～35%B; 41～52 min, 35%B～65%B; 52～57 min, 65%B ～95%B; 57～62 min, 95%B～10%B;進(jìn)樣量:10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)(λ)信息見表2。

表 1 色譜柱信息Table 1 Information of chromatographic columns

1.2.3樣品測(cè)定

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照1.2.2節(jié)液相色譜條件,用表1中的15款色譜柱在Waters e2695高效液相色譜儀和Agilent 1260高效液相色譜儀上分別進(jìn)行測(cè)定。記錄23種組分的保留時(shí)間、出峰順序等色譜柱的保留行為,并計(jì)算分離度(R)和理論塔板數(shù)(n)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同色譜柱的分離效果

在Waters e2695液相色譜儀上按照1.2.2節(jié)條件,分別用15款色譜柱對(duì)23種防腐劑組分進(jìn)行測(cè)試,從部分有代表性的色譜圖可以看出,不同品牌型號(hào)C18柱的分離效果存在明顯差異(見圖1)。經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn),在不改變規(guī)范方法流動(dòng)相洗脫程序等其他條件的前提下,15款色譜柱中只有2款色譜柱(Capcell Pak MG Ⅲ C18和ZORBAX SB-C18)能夠?qū)?3種組分完全分離,其他13款色譜柱都存在部分組分分離度不佳的情況。

圖 1 采用不同色譜柱在Waters e2695液相色譜儀上檢測(cè)23種防腐劑的色譜圖(λ=280 nm)Fig. 1 Chromatograms of the 23 preservatives using different chromatographic columns on Waters e2695 HPLC (λ=280 nm) Nos. 1-23 were consistent with the compound numbers in Table 2.

2.2 不同色譜柱對(duì)同類物質(zhì)的分離情況

4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸芐酯等同類物質(zhì)及同分異構(gòu)體保留時(shí)間相近,是色譜分離的關(guān)鍵點(diǎn)之一。色譜柱的分離效能最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)為分離度和理論板數(shù)。選取4-羥基苯甲酸丁酯為代表組分計(jì)算理論板數(shù)和其與相鄰色譜峰(前峰為4-羥基苯甲酸異丁酯,后峰為4-羥基苯甲酸芐酯)的分離度R1和R2(λ=254 nm),結(jié)果見表3?？梢钥闯?同一色譜柱在2臺(tái)儀器上的理論塔板數(shù)相近,不同色譜柱之間的理論板數(shù)差異較大,但理論板數(shù)和4-羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的分離效果不成正相關(guān);15款色譜柱中除5款色譜柱對(duì)于4-羥基苯甲酸丁酯和4-羥基苯甲酸異丁酯這組同分異構(gòu)體的分離效果稍差外,其余11款色譜柱都能實(shí)現(xiàn)基線分離(分離度≥1.5)。但是對(duì)于4-羥基苯甲酸丁酯和4-羥基苯甲酸芐酯,僅有6款色譜柱能實(shí)現(xiàn)良好分離。不同色譜柱對(duì)4-羥基苯甲酸酯類的保留行為選擇性差異較大,僅控制色譜柱柱效并不能保證該類物質(zhì)的分離效果。

2.3 不同色譜柱對(duì)不同類物質(zhì)的分離情況

選取對(duì)4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸丁酯、4-羥基苯甲酸芐酯等物質(zhì)分離效果較好的5款色譜柱,考察不同色譜柱對(duì)4-羥基苯甲酸甲酯、氯苯甘醚、脫氫乙酸、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷的分離情況。計(jì)算用Waters e2695液相色譜儀檢測(cè)時(shí),目標(biāo)組分與相鄰色譜峰的R值,結(jié)果見表4。可以看出,4-羥基苯甲酸甲酯、氯苯甘醚、脫氫乙酸、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷雖然結(jié)構(gòu)差異較大,檢測(cè)波長(zhǎng)也不同,但在C18色譜柱上保留行為相似,色譜峰的保留時(shí)間相近。這4種化合物在5款色譜柱上的分離度存在明顯差異,4-羥基苯甲酸甲酯和氯苯甘醚在InertSustain AQ-C18色譜柱上沒有完全分離。雖然4種化合物采用不同的檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)一定程度上減少了色譜峰分離度不足對(duì)定量結(jié)果帶來的影響,但是由于部分物質(zhì)在多個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收,如果與相鄰色譜峰不能實(shí)現(xiàn)基線分離,對(duì)低濃度待測(cè)組分檢測(cè)時(shí)仍會(huì)引起較大誤差。

表 3 4-羥基苯甲酸丁酯在不同色譜柱上的理論塔板數(shù)及與相鄰峰的分離度(λ=254 nm)Table 3 Plate counts (n) and resolutions (R) with two adjacent peaks of butyl 4-hydroxybenzoate using different chromatographic columns (λ=254 nm)

2.4 不同色譜柱對(duì)色譜峰出峰順序的影響

不同色譜柱對(duì)23種防腐劑的保留行為差異除了體現(xiàn)在分離度上之外,在色譜峰的出峰順序上也存在顯著不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在用Waters e2695液相色譜儀檢測(cè)時(shí),4-羥基苯甲酸(圖2中3號(hào)峰)和甲基氯異噻唑啉酮(圖2中4號(hào)峰)在7款色譜柱(DIAMONSIL C18、InertSustain AQ-C18、Xbridge Shield RP C18、Xselect T3、Capcell Pak MG C18、Capcell Pak MG Ⅱ C18和Capcell Pak MG Ⅲ C18)上的出峰順序和規(guī)范方法給出的參考色譜圖出峰順序相反。4-羥基苯甲酸和甲基氯異噻唑啉酮在Unitary C18和LUNA C18(2)這2款色譜柱上的色譜峰完全重疊,沒有分開(見圖2)。

對(duì)于化妝品中多組分檢測(cè)項(xiàng)目,實(shí)際工作中往往需要配制十幾種或幾十種標(biāo)準(zhǔn)溶液,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,極大制約了工作效率,因此一些試劑公司推出了按照規(guī)范方法預(yù)先配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液等產(chǎn)品。檢驗(yàn)人員在使用這些產(chǎn)品給工作帶來便捷的同時(shí),還應(yīng)注意由于色譜柱選擇不合適帶來的誤判問題。在標(biāo)準(zhǔn)方法或規(guī)范方法首次驗(yàn)證或更換色譜柱檢測(cè)時(shí),都應(yīng)當(dāng)使用單一化合物的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)色譜峰的出峰順序進(jìn)行確證。

2.5 等效色譜柱選擇系統(tǒng)的應(yīng)用

USP網(wǎng)站(https://apps.usp.org/app/USPNF/columnsDB. html)提供USP和PQRI數(shù)據(jù)庫(kù)中2種色譜柱相似度計(jì)算和預(yù)測(cè)工具。選擇參比色譜柱后,可獲得其他色譜柱與參比色譜柱相似度值(F),F越小,說明2款色譜柱的選擇性越相似,當(dāng)F≤3時(shí),認(rèn)為2款色譜柱的選擇性相似,可視為等效色譜柱。以規(guī)范方法制定單位在該方法編制說明中給出的色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18)為參比柱,查閱USP網(wǎng)站2個(gè)色譜柱數(shù)據(jù)庫(kù)提供的相似度值,將實(shí)驗(yàn)所用典型色譜柱的實(shí)際分離效果與數(shù)據(jù)庫(kù)選擇性差異的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見表5。

圖 2 采用不同色譜柱在Waters e2695液相色譜儀上 檢測(cè)時(shí)4-羥基苯甲酸和甲基氯異噻唑啉酮的色譜圖(λ=280 nm) Fig. 2 Chromatograms of 4-hydroxybenzoic acid and methylisothiazolinone using different chromatographic columns on Waters e2695 HPLC (λ=280 nm) 3. 4-hydroxybenzoic acid; 4. methylchloroisothiazolinone.

表 5 典型C18柱的實(shí)際分離效果與數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的比較Table 5 Comparison of practical separation results and predicted results based on the databases of typical C18 columns

USP數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果:有7款色譜柱收載于USP數(shù)據(jù)庫(kù)中,與ZORBAX SB-C18柱的相似度值FUSP全部小于3,然而實(shí)際分離效果中4-羥基苯甲酸和甲基氯異噻唑啉酮在5款色譜柱上出現(xiàn)峰重疊或出峰順序顛倒(見圖2),只有ZORBAX Extend-C18柱和Xbridge C18柱2款色譜柱得到的23種防腐劑的圖譜與參比柱的圖譜接近,但兩款色譜柱都存在部分色譜峰分離度達(dá)不到基線分離的現(xiàn)象(見表3)。

PQRI數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果:有12款色譜柱收載于PQRI數(shù)據(jù)庫(kù)中,查閱與ZORBAX SB-C18柱的相似度值FPQRI,可知12款色譜柱的相似度值均大于3,都不能視為等效色譜柱。盡管與參考色譜柱的相似度值為12.05,但是實(shí)際分離效果結(jié)果顯示,Capcell Pak MG Ⅲ C18柱仍能實(shí)現(xiàn)對(duì)23種組分的良好分離(見圖1)。

從現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,USP網(wǎng)站提供的2種色譜柱選擇數(shù)據(jù)庫(kù)無法預(yù)測(cè)出合適的等效色譜柱,對(duì)23種防腐劑的液相色譜分析參考價(jià)值均較小,這可能與待測(cè)組分結(jié)構(gòu)，以及其他色譜條件如流動(dòng)相pH和柱溫等因素有關(guān),進(jìn)而說明化妝品中多組分分析的復(fù)雜性。

2.6 應(yīng)對(duì)措施探討

液相色譜方法容易受到儀器型號(hào)、流動(dòng)相組成及其pH值、色譜柱、柱溫和流速等因素影響[14,15]。標(biāo)準(zhǔn)方法或規(guī)范方法會(huì)被不同實(shí)驗(yàn)室、不同人員在不同時(shí)間和試驗(yàn)條件下使用,可能會(huì)發(fā)生許多異?；蚱?。隨著液相色譜方法研究和應(yīng)用的深入,色譜系統(tǒng)適用性也逐漸受到重視,當(dāng)檢測(cè)結(jié)果容易受實(shí)驗(yàn)條件變化影響時(shí),應(yīng)當(dāng)對(duì)方法進(jìn)行合理控制或是指明注意事項(xiàng)?！吨袊?guó)藥典》2020年版第四部通則0512高效液相色譜法規(guī)定[16]:色譜參數(shù)除填充劑種類、流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外,其余如色譜柱內(nèi)徑與長(zhǎng)度、填充劑粒徑、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等,均可適當(dāng)調(diào)整以滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中對(duì)液相色譜方法的系統(tǒng)適應(yīng)性及如何進(jìn)行色譜參數(shù)調(diào)整均未做任何說明。方法應(yīng)用時(shí)如果遇到待測(cè)組分分離度不佳或雜質(zhì)峰干擾時(shí),實(shí)驗(yàn)人員勢(shì)必會(huì)對(duì)方法進(jìn)行改動(dòng),從而造成方法偏移。如果這種更改不加以指導(dǎo)和限制,就會(huì)給檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性帶來很多不可控因素。為解決上述問題,一方面,標(biāo)準(zhǔn)研制單位可以在方法開發(fā)初始,通過進(jìn)行耐用性試驗(yàn)對(duì)影響因素做出一定的模擬或預(yù)判,以保證方法的可靠性和有效性;另一方面,雖然為體現(xiàn)公正性和避免商業(yè)競(jìng)爭(zhēng),方法在非必要條件下一般不予公開方法制修訂時(shí)使用的色譜柱商標(biāo)等,但是如果測(cè)試條件對(duì)色譜柱要求苛刻,那么在規(guī)定色譜條件時(shí),可以參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[17,18]細(xì)化色譜柱分類和增加描述信息,并注明可以接受變動(dòng)的范圍,或者以標(biāo)準(zhǔn)方法釋義[19]、編制說明[20]或資料性附錄等方式,明確色譜柱具體參數(shù),以便于研究人員選擇合適的色譜柱,獲得最佳的分離效果。

3 結(jié)論

通過應(yīng)用《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中收載的23種防腐劑測(cè)定方法,對(duì)不同色譜柱分離效果進(jìn)行分析,并嘗試用等效色譜柱選擇系統(tǒng)對(duì)色譜柱進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:色譜柱是影響化妝品中23種防腐劑液相色譜法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素,不同品牌C18色譜柱的選擇性差異明顯,但目前仍缺乏能有效預(yù)測(cè)等效色譜柱的評(píng)價(jià)機(jī)制。有關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)在應(yīng)用規(guī)范方法時(shí),應(yīng)考慮色譜柱選擇性差異。建議化妝品標(biāo)準(zhǔn)(規(guī)范)管理部門在起草和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(規(guī)范)方法時(shí),增加系統(tǒng)適應(yīng)性和方法耐用性的考察要求,細(xì)化色譜柱的分類和系統(tǒng)篩選工作,指導(dǎo)色譜柱的合理選擇,減少因色譜柱選擇差異導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確等問題。如何在現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上,開發(fā)色譜柱的篩選和預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)體系,進(jìn)而指導(dǎo)實(shí)際樣品的分離以適應(yīng)化妝品基質(zhì)復(fù)雜的特點(diǎn)是下一步研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。