魏云計(jì), 鮑會(huì)梅, 何正和, 黃高明*, 馮 民, 朱臻怡, 何 健

(1. 淮安海關(guān), 國家飼料安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮安), 江蘇 淮安 223001; 2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 江蘇 淮安 223003)

氟蟲腈,商品名銳勁特,是法國羅納普朗克公司開發(fā)的一種含氟、氯的苯基吡唑類廣譜性殺蟲劑,對農(nóng)作物上的蚜蟲、鞘翅目、蠅類等害蟲有很高的殺蟲活性,與現(xiàn)有殺蟲劑無交互抗性,所以被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物。由于氟蟲腈也可殺滅虱子、跳蚤、螨蟲等寄生蟲,因此被作為殺蟲劑用于畜禽養(yǎng)殖場的衛(wèi)生消毒。殘留在飼料、水、環(huán)境中的氟蟲腈通過食物鏈進(jìn)入雞體內(nèi),導(dǎo)致了荷蘭“毒雞蛋”事件的發(fā)生。研究表明,短期大量攝食含氟蟲腈食品會(huì)對神經(jīng)系統(tǒng)造成損害,長期攝食含氟蟲腈食品會(huì)損害肝臟、腎臟、甲狀腺,甚至?xí)p害生殖系統(tǒng)[1],氟蟲腈對蝦類、蟹類等水生生物和蜜蜂有較高的風(fēng)險(xiǎn)[2]。氟蟲腈在環(huán)境中和動(dòng)物體內(nèi)不穩(wěn)定,會(huì)代謝成穩(wěn)定性和毒性更強(qiáng)的氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜3種主要代謝產(chǎn)物,歐盟已經(jīng)明令禁止氟蟲腈用于畜禽養(yǎng)殖過程中,規(guī)定食品最大限量為0.005 mg/kg,國際食品法典委員會(huì)規(guī)定動(dòng)物源性食品中氟蟲腈及其代謝物最大限量為0.02 mg/kg[3];我國農(nóng)業(yè)部1157號公告規(guī)定,自2009年10月1日起,除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外禁止使用氟蟲腈,GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對不同產(chǎn)品中的氟蟲腈及其代謝物也制定了詳細(xì)的最大殘留限量[4]。

食品中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定方法主要有氣相色譜法[5-7]、液相色譜法[8,9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-14]、液相色譜-質(zhì)譜法[15-18],這些方法主要針對植物源性的水果、蔬菜等樣品和動(dòng)物源性的雞蛋及雞肉,特別是“毒雞蛋”事件發(fā)生后,雞蛋、雞肉中氟蟲腈及其代謝物殘留量成為人們關(guān)注的焦點(diǎn),檢測方法已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道;而對于畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留量的分析方法報(bào)道較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)靈敏度高,抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn),在已有文獻(xiàn)[19-21]研究基礎(chǔ)上優(yōu)化前處理方法,對提取溶劑、分散固相萃取填料的種類及用量進(jìn)行考察,建立了畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留量測定的QuEChERS-HPLC-MS/MS方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Scientific Accela液相色譜儀、TSQ Quantum Ultra EMR質(zhì)譜儀(美國Thermo公司); ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm,美國Agilent公司); 3K15低溫冷凍離心機(jī)(德國); SB-5200DTD超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司); Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈、乙酸銨、甲酸均為色譜純,購自德國Merck公司;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷(C18)購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制:分別稱取適量的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解,配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃冰箱中避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用乙腈稀釋配制成100 mg/L高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,再用乙腈逐級稀釋配制成10 mg/L與1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中避光保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:移取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)需要用陰性樣品提取液稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

表 1 氟蟲腈及其代謝物的多反應(yīng)監(jiān)測模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters in multiple reaction monitoring (MRM) mode for fipronil and its metabolites

1.3 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5 g(精確至0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,在渦旋混合器上混勻30 s后,超聲提取15 min,以8 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移全部上清液至50 mL具塞離心管中,加入150 mg PSA、100 mg C18,渦旋1 min,以8 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:A為乙腈,B為水;流速:250 μL/min;進(jìn)樣量:25 μL。梯度洗脫程序:0～3.0 min, 20%A; 3.0～4.0 min, 20%A～60%A; 4.0～6.0 min, 60%A～90%A; 6.0～10.5 min, 90%A; 10.5～11.0 min, 90%A～20%A; 11.0～15.0 min, 20%A。

離子源:電噴霧離子(ESI)源,負(fù)離子掃描;離子源溫度:400 ℃;離子傳輸管溫度:350 ℃;噴霧電壓:3 000 V;鞘氣壓力:4.5 MPa;輔助氣壓力:1 MPa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測。其他質(zhì)譜條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的4種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動(dòng)泵分別直接注入質(zhì)譜儀中,進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟蟲腈及其代謝物在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng),但負(fù)離子模式下儀器響應(yīng)強(qiáng)度和穩(wěn)定性均優(yōu)于正離子模式,因?yàn)榉x腈及其代謝物分子結(jié)構(gòu)中均含有氨基,在正離子模式下有一定的響應(yīng),但待測化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)強(qiáng)負(fù)電性基團(tuán)-Cl、-F、-CN,易于吸附電子形成負(fù)離子,所以負(fù)離子模式的響應(yīng)遠(yuǎn)高于正離子模式,故選擇負(fù)離子模式進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,獲得[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰作為母離子。再對每個(gè)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,得到相應(yīng)的碎片離子信息,并優(yōu)化碰撞能量、碰撞氣、輔助氣、噴霧電壓、透鏡補(bǔ)償電壓等二級質(zhì)譜參數(shù),選擇離子豐度最高的碎片離子為定量離子,離子豐度次高的碎片離子作為定性離子,優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

氟蟲腈及其代謝物采用負(fù)離子監(jiān)測模式采集,流動(dòng)相體系一般為堿性或中性,文獻(xiàn)[22]采用酸性流動(dòng)相,本文考察了流動(dòng)相A相為乙腈、甲醇,B相為水、0.1%(v/v)甲酸溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%(v/v)甲酸)共8種組合流動(dòng)相體系下目標(biāo)物的分離效果、響應(yīng)強(qiáng)度及峰形。結(jié)果表明在上述8種流動(dòng)相體系下4種目標(biāo)化合物均出峰,在乙腈-水流動(dòng)相體系下響應(yīng)強(qiáng)度和峰形最佳,因此選擇乙腈-水作為流動(dòng)相。

2.3 提取溶劑的選擇

氟蟲腈及其代謝物易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑,實(shí)驗(yàn)采用陰性樣品添加1.0 μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮的提取效果。結(jié)果見圖1,乙腈沉淀蛋白的效果及提取效率最強(qiáng),提取液的顏色最澄清,4種有機(jī)溶劑中乙腈作為提取溶劑回收率最高;丙酮、甲醇和乙酸乙酯作為提取溶劑回收率較差,丙酮和乙酸乙酯提取的色素、脂肪等非極性干擾物比較多,不利于后續(xù)凈化;甲醇提取液渾濁且顏色最深,因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖 1 不同提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 1 Effect of different extraction solvents on recoveries of the target compounds

圖 2 填料用量對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 2 Effect of the amount of filler on recoveries of the target compounds

2.4 凈化方法的優(yōu)化

應(yīng)用QuECHERS方法進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析時(shí),常用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化炭黑(GCB) 3種填料作為吸附劑,PSA能夠去除基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素、金屬離子,C18能夠去除脂肪和脂類等弱極性干擾物,GCB主要用于吸附基質(zhì)中的色素。實(shí)驗(yàn)首先考察了3種填料對目標(biāo)物的吸附性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCB對4種目標(biāo)物的吸附率達(dá)31.7%～50.3%, PSA和C18無吸附性,故實(shí)驗(yàn)選擇PSA和C18兩種填料作為吸附劑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對填料的用量進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)了每種填料用量為50、100、150、200 mg 4個(gè)質(zhì)量水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖2,綜合考慮回收率、經(jīng)濟(jì)效益、凈化效果,最終凈化填料的使用量為150 mg PSA、100 mg C18。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

采用ESI源分析藥物殘留時(shí)普遍存在基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)影響檢測靈敏度、精密度及準(zhǔn)確度。消除基質(zhì)效應(yīng)的手段主要有優(yōu)化前處理方法、使用同位素內(nèi)標(biāo)、采用基質(zhì)匹配曲線、減少進(jìn)樣量等?；|(zhì)效應(yīng)以公式ME=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中氟蟲腈及其代謝物的峰面積/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中氟蟲腈及其代謝物的峰面積×100%計(jì)算,當(dāng)ME大于1時(shí)表示基質(zhì)增強(qiáng),ME小于1時(shí)表示基質(zhì)抑制。本文采用了梯度洗脫、分散固相萃取填料凈化、提取溶液凈化后不濃縮直接進(jìn)樣分析等方法,但依然存在基質(zhì)抑制效應(yīng),結(jié)果見表2,考慮經(jīng)濟(jì)因素,本文采用基質(zhì)匹配曲線校正回收率,保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 線性范圍與定量限

取1.2節(jié)配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.4節(jié)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定。以分析物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,氟蟲腈及其代謝物在0.1～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995;在陰性空白樣品中從低到高添加不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以定量離子對色譜峰的信噪比(S/N)大于3和10確定方法的檢出限和定量限分別為0.2 μg/kg和0.5 μg/kg,結(jié)果見表2。樣品中添加0.5 μg/kg目標(biāo)物的MRM色譜圖見圖3。

2.7 回收率及精密度

在陰性空白雞肝、鴨肝、鵝肝、豬肝4種樣品中分別添加0.5、1.0、10 μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加水平重復(fù)5次試驗(yàn),用基質(zhì)匹配曲線校正,外標(biāo)法定量,得到方法的回收率及精密度,見表3。

表 2 氟蟲腈及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and matrix effects (ME) of fipronil and its metabolites

圖 3 雞肝中添加0.5 μg/kg氟蟲腈及其代謝物的MRM色譜圖Fig. 3 Chromatograms of fipronil and its metabolites spiked in chicken liver sample (0.5 μg/kg) in MRM mode

表 3 畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of fipronil and its metabolites spiked in livestock and poultry liver (n=5)

2.8 實(shí)際樣品檢測

用本方法對29份雞肝、20份鴨肝、15份鵝肝、35份豬肝樣品進(jìn)行測定,僅3份雞肝、1份鴨肝樣品中檢測出氟蟲腈砜,含量分別為1.73、2.82、2.36、1.25 μg/kg,低于歐盟規(guī)定的最大殘留限量要求,其余3種化合物均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留的方法,優(yōu)化了前處理方法,提高了靈敏度和準(zhǔn)確性,本方法操作快速、簡單,穩(wěn)定性好,檢測成本低,方法的檢出限、回收率、精密度符合要求,適用于畜禽肝臟中氟蟲腈及其代謝物殘留檢測。