郭民康, 張 健

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科, 重慶 400016)

股骨頭壞死(ONFH)是一種可導(dǎo)致股骨頭塌陷進(jìn)而需要接受全髖關(guān)節(jié)置換的疾病。該病嚴(yán)重影響患者的日常生活,給社會(huì)造成了重大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),但其發(fā)生機(jī)制和病理生理仍不清楚[1,2]。Bartolmas等[3]證實(shí)甘油磷脂在調(diào)節(jié)生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。溶血磷脂酸(LPA)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成。在小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型中,脂質(zhì)代謝紊亂與骨吸收和骨形成的失衡密切相關(guān)[4]。同時(shí),許多研究認(rèn)為脂質(zhì)代謝紊亂為ONFH的代謝特征之一[5-7]。

外泌體是一種直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡,被雙層脂膜包裹,其分泌由細(xì)胞高度調(diào)控[8]。外泌體作為一種細(xì)胞間交流的方式,在一系列生理和病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。外泌體可以在受體細(xì)胞中產(chǎn)生生物反應(yīng),并轉(zhuǎn)運(yùn)小分子代謝物[9]。據(jù)報(bào)道,骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體參與血管生成,調(diào)節(jié)骨代謝[10]。前期研究表明,來(lái)自正常股骨頭組織的外泌體可減少糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠模型ONFH的發(fā)生,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和遷移;基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析,血小板表面糖蛋白(CD41)缺陷的外泌體可導(dǎo)致ONFH的發(fā)生,但來(lái)自正常骨骼的外泌體可以改善ONFH的進(jìn)展[11],然而其機(jī)制尚不清楚,因?yàn)橥饷隗w包含代謝產(chǎn)物等分子。因此,進(jìn)一步研究來(lái)自O(shè)NFH骨組織外泌體中代謝物的作用是必要的,這可能為外泌體介導(dǎo)的代謝途徑提供思路,加深我們對(duì)ONFH的理解。

表 1 入組樣本的臨床信息(n=30)Table 1 Clinical information of the enrolled samples (n=30)

代謝組學(xué)是對(duì)某一生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有相對(duì)分子質(zhì)量較低代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門(mén)新學(xué)科[12]。代謝物是細(xì)胞功能的組成部分,被認(rèn)為擁有大量能預(yù)測(cè)表型的信息[13]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)以其高精度和高靈敏度被廣泛用于組學(xué)分析[14,15]。本研究基于UPLC-MS/MS的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)分析了來(lái)源于ONFH骨組織外泌體內(nèi)脂質(zhì)代謝物的變化。本研究旨在為觀察ONFH提供一個(gè)新的視角,并探索ONFH疾病外泌體中可能的代謝變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜系統(tǒng)(UltiMate 3000)、超速離心機(jī)(Sorvall WX)(美國(guó)Thermo Fisher公司);透射電子顯微鏡(H-7650,日本Hitachi公司);動(dòng)態(tài)光散射儀(LS-13,美國(guó)Berkam公司); Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm, 美國(guó)Phenomenex公司); Triple TOF 5600 LC-MS系統(tǒng)(美國(guó)SCIEX公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

RIPA裂解液和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;乙腈和甲醇(色譜級(jí),美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸(色譜級(jí),德國(guó)CNW公司);聚偏氟乙烯膜(美國(guó)Millipore Corporation公司);洗膜緩沖液(TBST)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS, 0.01 mol/L, PH 7.4)和5%牛血清白蛋白封閉液(BSA)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;第一抗體：Alix-1和CD63均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司，TSG101購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；第二抗體：辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 樣本收集

所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。本研究中的捐贈(zèng)者均充分了解知情同意書(shū)的內(nèi)容,同時(shí)也獲得了每位捐贈(zèng)者的書(shū)面知情同意。ONFH患者的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)X射線、核磁共振(MRI)及病理表現(xiàn)與ONFH診斷一致;(2)根據(jù)國(guó)際骨循環(huán)研究會(huì)(ARCO)分期,患者處于Ⅲ～Ⅳ期;(3)患者未出現(xiàn)嚴(yán)重內(nèi)源性疾病、畸形性骨炎、代謝性骨病、轉(zhuǎn)移性骨癌、甲狀旁腺功能亢進(jìn)等疾病。本研究涉及30例ONFH患者及30例股骨頸骨折(FNF)患者的標(biāo)本?；颊叩娜丝趯W(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

1.3 超速離心法提取外泌體

外泌體的分離純化采用多級(jí)超速離心法進(jìn)行。將500 mg股骨頭組織充分研磨后與PBS混合,于4 ℃條件下以300 g離心10 min,隨后將上清液吸至另一高速離心管中,于4 ℃下以10 000 g離心30 min,最后取上清液,于4 ℃下以100 000 g離心70 min,獲得外泌體沉淀,使用PBS對(duì)外泌體進(jìn)行重懸洗滌,以100 000 g離心70 min,獲得純凈的外泌體沉淀。最后,用PBS吹打外泌體,用0.22 μm濾器過(guò)濾,外泌體溶液的含量為1.9×1011particles/mL,保存于-80 ℃。

1.4 蛋白免疫印跡分析

向外泌體樣本中加入RIPA裂解液,在冰上裂解20 min后,以13 000 r/min離心30 min提取總蛋白質(zhì)。BCA試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,蛋白質(zhì)上樣量為每孔30 μg。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離程序:以80 V電壓運(yùn)行30 min進(jìn)行濃縮,以120 V電壓運(yùn)行60 min進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)膜程序:以210 mA電流運(yùn)行90 min,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,在5% BSA中室溫?fù)u床封閉1 h。將封閉好的PVDF膜先在雙蒸水中清洗掉封閉液,然后放入洗膜緩沖液(TBST)中,搖床每次清洗7 min,共3次。PVDF膜在4 ℃冰箱中與第一抗體孵育12 h后,PVDF膜放入TBST,搖床每次清洗7 min,共3次。最后,PVDF膜與第二抗體孵化1 h。

1.5 代謝物的提取

外泌體按照之前的方案制備樣品[16]。具體實(shí)驗(yàn)步驟:以100 Hz超聲持續(xù)5 min破碎外泌體,然后加入100 μL乙腈,于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min以去除微粒。取40 μL上清液,用60 μL蒸餾水稀釋。將60 μL上清液裝入玻璃自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。每一組的剩余上清取10 μL作為質(zhì)控組。

1.6 分析條件

1.6.1色譜條件

色譜柱:Kinetex XB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.3 mL/min,樣品室溫度:8 ℃。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%B; 1.0～8.0 min, 10%B～80%B; 8.0～12.0 min, 80%B; 12.0～15.0 min, 80%B～10%B。進(jìn)樣量:60 μL。

1.6.2質(zhì)譜條件

質(zhì)量掃描范圍m/z: 100～1 000,鞘氣壓力為380 kPa,輔助氣壓力為380 kPa,氣簾氣壓力為170 kPa,霧化溫度為600 ℃,采用飛行時(shí)間質(zhì)譜全掃描-信息關(guān)聯(lián)采集-子離子掃描(TOF-MS scan-IDA-product ion scan)復(fù)合模式,TOF-MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描IDA離子累積時(shí)間分別為250、100 ms,采用多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)作為二級(jí)觸發(fā)條件,解簇電壓為±80 V,碰撞能量疊加為(35±15) eV。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將所得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)MarkView軟件轉(zhuǎn)化后,進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、扣除溶劑峰、雜質(zhì)峰、濾噪等處理,利用快捷峰視圖(Shortcut to PeakView)技術(shù),通過(guò)化學(xué)智能峰匹配算法促進(jìn)碎片離子分析過(guò)程,使用MMCD (http://mmcd.nmrfam.wisc.edu/)和HMDB (http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,由導(dǎo)出的數(shù)據(jù)表得到三維矩陣。經(jīng)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1,進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。依據(jù)正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模型中變量投影重要性值(VIP值>1)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(P<0.05)篩選差異代謝物。

圖 1 股骨頭的組織圖像和免疫組化圖片F(xiàn)ig. 1 Tissue and immunohistochemical images of femoral heada. X-ray image of osteonecrosis of femoral head; b. magnetic resonance imaging (MRI) image of osteonecrosis of the femoral head; c. bone tissue specimen of femoral head; d. hematoxylin-eosin (HE) staining of bone tissues.

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)受試者進(jìn)行圖像和組織學(xué)分析

ONFH患者的X射線圖像顯示股骨頭密度變化,負(fù)重區(qū)塌陷,關(guān)節(jié)間隙狹窄(見(jiàn)圖1a)。MRI圖像顯示軟骨下骨折,信號(hào)強(qiáng)度較低(見(jiàn)圖1b)。股骨頭的大體形狀如圖1c所示,ONFH標(biāo)本可見(jiàn)局灶性壞死區(qū)均勻改變,脂肪增多。蘇木精-伊紅染色法(HE)染色顯示,ONFH骨組織存在壞死、纖維化、骨髓腔紊亂以及骨吸收(見(jiàn)圖1d)。以上結(jié)果提示,ONFH患者股骨頭的組織病理發(fā)生了改變。

2.2 外泌體的鑒定

對(duì)分離富集得到的外泌體,分別進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析、蛋白免疫印跡分析和透射電子顯微鏡(TEM)分析。DLS的結(jié)果顯示,這些外泌體的大小大都在30～150 nm之間(見(jiàn)圖2a)。圖2b顯示,外泌體的標(biāo)記物CD63、Alix和TSG101顯著富集。最后對(duì)外泌體進(jìn)行了TEM分析,直接觀察其形貌,結(jié)果如圖2c所示,外泌體為雙層脂質(zhì)包裹,類(lèi)圓盤(pán)狀形態(tài),大小在100 nm左右。以上結(jié)果表明組織中的外泌體已成功分離。

圖 2 外泌體的鑒定Fig. 2 Identification of exosomes (EXO)a. exosomes particle size distribution; b. western blotting analysis of markers in EXO; c. transmission electron microscope (TEM) picture of EXO.

2.3 外泌體中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物譜

采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)鑒別差異表達(dá)的代謝物。

外泌體樣本經(jīng)上述條件分析后得到的數(shù)據(jù),經(jīng)處理后得到PCA圖(見(jiàn)圖3a)。結(jié)果顯示,來(lái)自于ONFH的外泌體的成分和來(lái)自于FNF的外泌體的成分在維度上,二者有一定的分離趨勢(shì),反映了ONFH的病理生理變化。通常情況下,R2Y、Q2高于0.5較好,高于0.4即可接受,且兩者差值不應(yīng)過(guò)大。臨床樣本由于個(gè)體差異大,不可控,尤其大樣本時(shí),R2Y、Q2大小為0.2左右亦可。

模型評(píng)價(jià)參數(shù)R2Y、Q2分別為0.749、0.724, 均大于0.5,表明模型穩(wěn)定可靠(見(jiàn)圖3b)。表明OPLS-DA模型建立成功，來(lái)源于ONFH和FNF骨組織的外泌體分離趨勢(shì)較好。

圖 3 FNF和ONFH患者的外泌體樣本的(a)PCA和 (b)OPLS-DA評(píng)分圖Fig. 3 (a) Principal component analysis (PCA) and (b) orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA) score plots of exosomes samples from FNF and ONFH patients

2.4 差異代謝物熱圖

根據(jù)VIP >1和變化倍數(shù)>2的標(biāo)準(zhǔn),在外泌體的脂質(zhì)代謝物中篩選了18個(gè)差異代謝物(見(jiàn)表2),包括丙烯醇脂類(lèi)、脂肪酸酯類(lèi)、甘油酯類(lèi)及其衍生物。熱圖顯示了表2中差異代謝物的變化:在ONFH中有12個(gè)脂質(zhì)代謝物的表達(dá)增加,而其他6個(gè)脂質(zhì)代謝物的表達(dá)減少(見(jiàn)圖4)。

2.5 代謝途徑分析

將脂質(zhì)代謝物(見(jiàn)附表1，詳見(jiàn)http://www.chrom-China.com)導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行代謝通路分析。代謝通路分析顯示,甘油磷脂代謝和鞘脂類(lèi)代謝通路在來(lái)自于ONFH的外泌體中發(fā)生了較大的改變(見(jiàn)圖5)。有研究表明,鞘脂和甘油磷脂之間的不平衡導(dǎo)致脂肪毒性損傷,這與常見(jiàn)代謝性疾病的病理生理學(xué)有關(guān)[17]。Han等[18]認(rèn)為,甘油磷脂代謝途徑對(duì)人類(lèi)多能干細(xì)胞的多能性和生存的鐵穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。還有研究揭示了甘油磷脂與細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間具有相關(guān)性,甘油磷脂比例的變化可以反映脂質(zhì)代謝的紊亂[19]。Zhu等[16]的研究認(rèn)為,在ONFH疾病中,脂質(zhì)代謝紊亂是一個(gè)重要的病理因素。外泌體內(nèi)的甘油磷脂代謝和鞘脂類(lèi)代謝可能也代表了疾病本身的代謝變化。

表 2 外泌體差異代謝物列表Table 2 List of the identified differential metabolites in exosomes

圖 4 差異代謝物的熱圖Fig. 4 Heatmap of differential metabolite

圖 5 ONFH患者外泌體中已鑒定代謝物的代謝途徑分析Fig. 5 Metabolic pathway analysis of the identified metabolites in exosomes of ONFH patients

3 結(jié)論

在本研究中,使用基于UPLC-MS/MS的非靶向代謝組學(xué)方法識(shí)別來(lái)源于ONFH和對(duì)照組股骨頭組織的外泌體之間的脂質(zhì)代謝差異,并發(fā)現(xiàn)了ONFH外泌體的代謝特征,共鑒定出18種差異代謝產(chǎn)物,包括丙烯醇脂類(lèi)、脂肪酸酯類(lèi)、甘油酯類(lèi)及其衍生物。脂質(zhì)代謝紊亂是ONFH的基本特征之一,外泌體脂質(zhì)代謝組學(xué)可能是揭露ONFH疾病脂質(zhì)代謝變化的一個(gè)重要方法。