孫 強, 李玉博, 溫廣月, 王偉民, 董茂鋒, 唐紅霞

(上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)藥安全評價研究中心, 上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所, 上海 201106)

乙拌磷是一種有機磷殺蟲劑,其化學名稱為O,O-二乙基-S-2-乙硫基乙基二硫代酸酯,可用于防治棉花、甜菜、馬鈴薯等苗期蚜蟲、葉螨及地下害蟲等,具有內(nèi)吸、觸殺、胃毒及熏蒸作用。乙拌磷純品是一種具有惡臭味的無色油狀物,易溶于正己烷、二氯甲烷、異丙醇和甲苯,難溶于水,在堿性條件下會分解失效。乙拌磷是一種高毒類有機磷農(nóng)藥,人體吸入、食入和經(jīng)皮吸收后會抑制膽堿酯酶活性,造成神經(jīng)功能紊亂,在環(huán)境中難降解,在生物體內(nèi)富集,干擾生物體的內(nèi)分泌機制,對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成巨大危害[1-3]。乙拌磷在動植物體內(nèi)均快速吸收和代謝,主要代謝產(chǎn)物是乙拌磷砜和乙拌磷亞砜,以及他們相應的氧類似物及二乙基硫代磷酸酯[4],而且代謝物的降解速度均比乙拌磷緩慢[3]。我國規(guī)定劇毒、高毒農(nóng)藥不得用于防治衛(wèi)生害蟲,不得用于蔬菜、瓜果、茶葉、菌類、中草藥材的生產(chǎn)[5]。因此,為確保食品質(zhì)量安全,開發(fā)農(nóng)產(chǎn)品中乙拌磷及其代謝物的檢測方法至關重要。

目前《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]和農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議(JMPR)[7]將乙拌磷的殘留定義為乙拌磷、硫醇式-內(nèi)吸磷以及它們的亞砜化物和砜化物含量之和,以乙拌磷表示。文獻報道測定植物源食品中乙拌磷的方法包括氣相色譜法[8]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]。有報道采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]檢測人體血液和尿液中乙拌磷及其5個代謝物殘留量;氣相色譜法[3]測定種植咖啡土壤中乙拌磷的降解和遷移,檢測乙拌磷及其5個代謝物;雙氣相色譜-雙脈沖火焰光度法[10]檢測動物性食品中乙拌磷、乙拌磷亞砜、乙拌磷砜和內(nèi)吸磷-S;固相萃取柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]檢測當歸中乙拌磷、乙拌磷砜和乙拌磷亞砜。但是鮮有檢測植物源性食品中乙拌磷及其5個代謝物的相關報道。因此,為保證植物源農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,本研究擬采用UHPLC-MS/MS建立靈敏度高、簡便快速的定量分析乙拌磷及其代謝物的殘留方法。

目前農(nóng)藥殘留前處理方法主要有固相萃取法、分散液液萃取法和分散固相萃取法等[12-14]。固相萃取法操作步驟復雜且時間長,消耗溶劑量大,商品化固相萃取小柱種類多,由于化合物結構特點不同,難以選擇一種合適的固相萃取小柱;分散液液萃取法需要消耗大量的有機溶劑且當化合物存在干擾時,無有效的解決措施;分散固相萃取法結合了液液萃取和固相萃取的原理,利用少量吸附劑加入到提取液吸附雜質(zhì),起到凈化效果。對比固相萃取法和分散液液萃取法,分散固相萃取操作步驟簡單、快速,凈化過程中不用額外的有機試劑。

本研究根據(jù)目標化合物的性質(zhì),采用分散固相萃取法,結合國際食品法典委員會(CAC)和我國關于乙拌磷的殘留限量要求,建立了5種典型性農(nóng)產(chǎn)品(豌豆、蘆筍、小麥、咖啡豆和花生)中乙拌磷及其代謝物農(nóng)藥殘留的UHPLC-MS/MS測定方法。本方法具有操作簡單便捷,適用于谷物、油料、蔬菜等多種基質(zhì)中乙拌磷及其代謝物的定性和定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜儀、8060三重四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧電離(ESI)源)(日本Shimadzu公司); MX-F渦動混合器(中國Dragonlab公司); 5415D離心機(德國Eppendorf公司)。

乙拌磷(99.4 mg/L)、乙拌磷砜(1 000.1 mg/L)、乙拌磷亞砜(1 000 mg/L)、內(nèi)吸磷-S(1 000.2 mg/L)、內(nèi)吸磷-S-亞砜(純度96%)購自北京振翔科技有限公司;內(nèi)吸磷-S-砜(100 mg/L)購自天津阿爾塔科技有限公司。乙腈和甲醇(色譜純)購自美國Merck公司;甲酸和乙酸銨(色譜純)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;氯化鈉和無水硫酸鎂(分析純)購自上?；瘜W試劑公司。多壁碳納米管(MWCNT)、羥基化多壁碳納米管(OH-MWCNTs)、羧基化多壁碳納米管(COOH-MWCNTs)購自江蘇先豐納米材料科技有限公司;辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)購自上海安譜實驗科技股份有限公司;氨丙基粉(NH2)、中性氧化鋁(N-Al2O3)、硅膠鍵合苯基磺酸強陽離子交換吸附劑(SCX)購自安捷倫科技(中國)有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)和石墨化炭黑(GCB)購自日本Shimadzu公司。

樣品:在廣西、河南、南京和上海分別采集10批次小麥,總計40個樣品;在河南、上海、浙江和山東分別采集10批次花生,總計40個樣品?？Х榷?鮮)等其他樣品均購于網(wǎng)絡。

1.2 標準溶液配制

準確稱取內(nèi)吸磷-S-亞砜10.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,得到960 mg/L的內(nèi)吸磷-S-亞砜標準儲備液。

分別量取1.006、0.100、0.100、0.100、0.104和1.000 mL的乙拌磷、乙拌磷砜、乙拌磷亞砜、內(nèi)吸磷-S、內(nèi)吸磷-S-亞砜和內(nèi)吸磷-S-砜標準儲備液,用甲醇定容至10 mL,得到混合標準中間液。將上述混合標準中間液用空白基質(zhì)提取液稀釋成質(zhì)量濃度為2、10、50、100、200 μg/L的系列混合標準溶液。

所有標準溶液均保存于-(18±2) ℃條件下。

1.3 樣品前處理

將豌豆或蘆筍樣品切碎、勻漿,將小麥、咖啡豆或花生樣品粉碎后充分混勻。

稱取試樣5.0 g(精確至0.001 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈(其中小麥、咖啡豆或花生樣品先加入5 mL水潤濕),渦旋提取10 min,加入4 g氯化鈉,再次渦旋30 s,再以4 000 r/min離心5 min,準確移取1.5 mL提取上清液至盛有50 mg C18、50 mg PSA和50 mg NH2的2 mL凈化離心管中,渦旋1 min后,以10 000 r/min離心2 min,取上清液過0.22 μm有機微孔濾膜后上機測定。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

Thermo Syncronis C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫40 ℃;流動相A為乙腈,B為水;流速0.50 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～6.0 min, 10%A～90%A; 6.0～7.0 min, 90%A; 7.0～7.5 min, 90%A～10%A; 7.5～10 min, 10%A。進樣量2 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

ESI+檢測方式;多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子源接口電壓:3.5 kV;脫除溶劑管(DL管)溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;霧化氣流速:3.0 L/min (N2,純度99.999%);干燥氣流速:15 L/min(N2,純度99.999%)。乙拌磷及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

首先,對乙拌磷及其代謝物的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,將目標化合物的標準溶液在ESI+和ESI-兩種模式下進行掃描。結果顯示,乙拌磷及其代謝物在ESI+模式下得到[M+H]+準分子離子峰,質(zhì)譜信號響應比ESI-模式強,因此選擇正離子模式開展后續(xù)優(yōu)化。選擇乙拌磷及其代謝物的特征準分子離子峰為前體離子進行二級質(zhì)譜分析,每個目標化合物選取2對響應最強的特征離子作為定性離子,以響應值最大的碎片離子為定量離子,自動優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù),乙拌磷及其代謝物的最佳質(zhì)譜條件見表1。

表 1 乙拌磷及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of disulfoton and its metabolites

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱選擇

實驗對比了Agilent EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm)、Thermo Syncronis C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)、Waters Acquity C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Shimadzu InertSustainSwift C18(50 mm×2.1 mm, 3 μm)4種液相色譜柱對乙拌磷及其代謝物的分離效果。如圖1所示,所有化合物在4種色譜柱上均能實現(xiàn)有效保留及分離,但采用Agilent EC-C18和Thermo Syncronis C18色譜柱時峰形對稱性好，半峰寬窄,且出峰時間相同,但采用Thermo Syncronis C18色譜柱時峰面積明顯高于Agilent EC-C18色譜柱。因此最終選擇Thermo Syncronis C18色譜柱進行分離。

圖 1 采用不同色譜柱時乙拌磷及其代謝物(0.05 mg/L) 的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ions chromatograms of disulfoton and its metabolites (0.05 mg/L) with different columnsa. Agilent EC-C18 (100 mm×3.0 mm, 2.7 μm); b. Thermo Syncronis C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μm); c. Waters Acquity C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); d. Shimadzu InertSustainSwift C18 (50 mm×2.1 mm, 3 μm). Peak identifications: 1. disulfoton sulfoxide; 2. disulfoton sulfone; 3. demeton-S; 4. demeton-S sulfoxide; 5. demeton-S sulfone; 6. disulfoton.

圖 2 采用不同流動相時乙拌磷及其代謝物(0.05 mg/L) 的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ions chromatograms of disulfoton and its metabolites (0.05 mg/L) with different mobile phases a. methanol-water; b. acetonitrile-water; c. acetonitrile-0.05% formic acid aqueous solution. Peaks 1-6 were the same as that in Fig. 1.

2.2.2流動相選擇

對于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,流動相條件是影響目標化合物分離度和響應的一個重要方面。在水相中添加甲酸銨或甲酸等試劑是改善色譜峰形、提高儀器響應值和離子化效率的常用手段,通常采用酸性流動相有利于在正離子模式下進行質(zhì)譜檢測,而甲酸是最常用的試劑之一。以乙拌磷及其代謝物的質(zhì)量濃度為0.05 mg/L為實驗條件,首先比較甲醇-水(見圖2a)和乙腈-水(見圖2b)兩種流動相對6種化合物分離度的影響。結果表明,采用乙腈-水作為流動相,乙拌磷及其代謝物的分離度明顯優(yōu)于甲醇-水。其次比較了乙腈-水和乙腈-0.05%甲酸水(見圖2c)兩種流動相對6種化合物響應的影響。如圖顯示,6種化合物在乙腈-水流動相中,峰高更高。因此最終采用乙腈-水作為流動相。

2.3 吸附劑種類的優(yōu)化

實驗選擇MWCNTs、OH-MWCNTs、COOH-MWCNTs、C8、C18、NH2、SCX、N-Al2O3、GCB和PSA 10種常見的分散固相萃取吸附材料,考察了其對目標化合物的吸附情況。分別稱取10 mg MWCNTs、OH-MWCNTs、COOH-MWCNTs和50 mg C8、C18、NH2、SCX、N-Al2O3、GCB和PSA,對乙拌磷及其代謝物(0.05 mg/L)在乙腈中吸附情況進行考察。如圖3a結果所示,MWCNTs、OH-MWCNTs、COOH-MWCNTs、C8、SCX或N-Al2O3凈化時內(nèi)吸磷-S亞砜的回收率都低于56.2%; GCB凈化時,乙拌磷的回收率偏低(71.5%);其余3種吸附劑(C18、NH2或PSA)凈化時,乙拌磷及其代謝物的回收率為87.9%～109.0%,均能滿足檢測方法的要求。

圖 3 不同吸附劑對乙拌磷及其代謝物(a、b)回收率和(c)基質(zhì)效應的影響(n=5)Fig. 3 Effect of different sorbents on the (a, b) recoveries and (c) MEs of disulfoton and its metabolites (n=5) MWCNTs: multiwalled carbon nanotubes; SCX: strong cation exchange.

2.4 吸附劑用量的優(yōu)化

C18主要吸附脂類和甾醇等非極性雜質(zhì)[15], NH2主要吸附碳水化合物和部分脂肪[16], PSA主要吸附極性有機酸、脂肪酸、極性色素和糖[15,17]。鑒于本方法擬適用于谷物、油料和蔬菜等多種基質(zhì),選擇了具有代表性的花生(油脂類)、蘆筍(高含水蔬菜類)、小麥(谷物類)3種基質(zhì)進一步開展C18、NH2和PSA不同組合的回收率和基質(zhì)效應的評價。

結合上述實驗結果,以高含油量作物(花生)、高含水量作物(蘆筍)和高淀粉含量作物(小麥)為基質(zhì),分別選定不同吸附材料(見圖3b)處理凈化后的提取液配制乙拌磷及其代謝物的標準溶液(0.05 mg/L),進行添加回收評價。如圖3b所示,7種吸附劑組合方式下，乙拌磷及其代謝物在花生、蘆筍和小麥中的回收率均無明顯影響,目標化合物的回收率為81.0%～109.3%,相對標準偏差(RSD)為0.6%～12.5%,均滿足分析方法要求。

2.5 基質(zhì)效應的探究

國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)定義基質(zhì)效應是指樣品中除分析物以外的其他成分對待測物測定值的綜合影響?；|(zhì)效應一般受分析儀器、樣品基質(zhì)、前處理方式等因素的影響[12,18]。樣品基質(zhì)中存在對待測成分有干擾的化合物,在UHPLC-MS/MS分析中,離子化過程時,干擾成分同待測成分離子化競爭,從而引起待測成分信號抑制或增強,對方法的靈敏度、精密度和準確度造成影響。

根據(jù)文獻[15,19]報道, ME=(基質(zhì)中分析物的峰面積/純?nèi)軇┲蟹治鑫锏姆迕娣e-1)×100%。當ME>0,為基質(zhì)增強效應;當ME=0,無基質(zhì)效應;當ME<0,為基質(zhì)抑制效應。一般認為當|ME|≤20%,認為該基質(zhì)沒有基質(zhì)效應;若在20%～50%之間,表明有中等基質(zhì)效應;當大于50%,對目標化合物有較強的基質(zhì)效應。實驗比較了溶劑標準溶液(0.05 mg/L)、7種吸附劑組合方式凈化后基質(zhì)匹配標準溶液和未凈化的基質(zhì)匹配標準溶液。

由圖3c可知,乙拌磷及其代謝物在7種預定方式凈化后,基質(zhì)效應絕對值均呈明顯下降,但是采用50 mg PSA、50 mg NH2和50 mg C18混合時凈化效果最佳。在3種吸附材料凈化條件下,仍然有部分|ME|值超過20%(花生基質(zhì)中的乙拌磷和蘆筍基質(zhì)中的硫醇式-內(nèi)吸磷亞砜)。因此,為了確保分析方法的準確性,尤其在油料和蔬菜基質(zhì)中,仍然需要通過配制基質(zhì)標準溶液進行定量分析。

2.6 線性關系、相關系數(shù)和檢出限

根據(jù)1.2節(jié)配制基質(zhì)混合標準溶液,分別進樣2 μL,在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進行測定,以各分析物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標,以其相應的峰面積(y)為縱坐標,得到各分析物的線性方程。結果顯示,乙拌磷及其代謝物在2.0～200.0 μg/L線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關系,相關系數(shù)(R2)≥0.998 1。乙拌磷及其代謝物的檢出限(LOD)為3倍信噪比所對應的含量,為0.02～2.0 μg/kg(見表2)。根據(jù)歐盟文件SANTE/11813/2017規(guī)定,當最小添加水平回收率滿足70%～120%及相對標準偏差≤20%時,定量限(LOQ)可以為最小添加水平。本實驗的最小添加水平為5 μg/kg,乙拌磷及其代謝物的回收率≥75.0%, RSD≤14.9%,因此乙拌磷及其代謝物的LOQ為5 μg/kg。

表 2 乙拌磷及其代謝物的回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、回收率和相對標準偏差(n=5)Table 2 Regression equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), recoveries and RSDs of disulfoton and its metabolites (n=5)

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.7 回收率和精密度

選擇不含待測物的樣品(豌豆、蘆筍、小麥、咖啡豆和花生)進行添加回收試驗,添加水平分別為5、100和1 000 μg/kg,每個樣品基質(zhì)做5次平行試驗,最高添加水平用空白基質(zhì)稀釋5倍后檢測。結果如表2所示,乙拌磷及其代謝物的回收率為75.0%～110.0%, RSD為0.7%～14.9%。符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則》的要求[20]。

2.8 實際樣品的測定

選取各地市售的40份小麥、40份花生樣品,采用所建立的方法,按照最優(yōu)實驗條件進行乙拌磷及其代謝物殘留的檢測。檢測結果顯示,所有樣品均未檢出乙拌磷及其代謝物。

3 結論

本文建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定乙拌磷及其代謝物在不同農(nóng)產(chǎn)品中的檢測方法,該方法有較好的檢測靈敏度和準確度。該方法操作簡單,靈敏度高,回收率高,準確度好,檢出限低,滿足定性和定量要求,適用于高含水類、高淀粉含量類和高含油量類作物中乙拌磷及其代謝物的檢測,可為乙拌磷在高淀粉含量類和高含油量類作物的風險監(jiān)控提供有效的技術支持。