杜秋瑤, 張?jiān)品? 王繼芬, 趙 鵬, 吳小軍, 董林沛, 李佳宜, 劉冰潔

(1. 公安部物證鑒定中心, 北京 100038; 2. 中國(guó)人民公安大學(xué)偵查學(xué)院, 北京 100038; 3. SCIEX亞太應(yīng)用支持中心, 北京 100015)

指印中包含多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì),如脂質(zhì)、氨基酸、化妝品、藥物、毒物、爆炸殘留物等,其中蘊(yùn)含著指印供體的生物特征、社會(huì)習(xí)性等相關(guān)信息[1-5]。通過(guò)對(duì)指印分析,可對(duì)供體進(jìn)行特征刻畫,從而為案件偵查提供線索。該方法在無(wú)法通過(guò)指印進(jìn)行個(gè)體識(shí)別時(shí)有更加重要的意義[6]。另一方面,使用指印作為替代性生物基質(zhì)進(jìn)行藥物檢測(cè)是一個(gè)新的研究方向[7]。與典型的生物樣品(例如血液和尿液)相比,指印采樣和提取更加簡(jiǎn)單快捷,具有非侵入性,并且采樣過(guò)程易于觀察,難以摻假[8,9]。

高血壓患者在我國(guó)人數(shù)多、分布廣,近年來(lái)呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì),且需要長(zhǎng)期服藥[10]。因此可通過(guò)檢測(cè)指印中的降壓藥,獲得供體服藥及患病的相關(guān)信息,為偵查方向提供依據(jù)。此外,該方法還可用于定性藥物監(jiān)測(cè)或藥物測(cè)定。降壓藥種類繁多,已有大量文獻(xiàn)[11]報(bào)道了各類藥物的作用機(jī)理、代謝規(guī)律和相互影響等,但指印中降壓藥的檢驗(yàn)仍需要系統(tǒng)的研究。

檢測(cè)指印中化學(xué)物質(zhì)的方法包括光譜法[12,13]、免疫分析法[14,15]、色譜法[16,17]和質(zhì)譜法[18-20]等。近年來(lái),超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)由于其優(yōu)越的靈敏度和選擇性而成為各種基質(zhì)中藥物測(cè)定的首選技術(shù)[21]。但大多數(shù)UPLC-MS/MS使用的是三重四極桿(QQQ)或飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜,而使用三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(Q-TRAP/MS)檢測(cè)指印中藥物的研究則鮮有報(bào)道[22]。UPLC-Q-TRAP/MS的可編程多反應(yīng)監(jiān)測(cè)-信息關(guān)聯(lián)采集-增強(qiáng)子離子(SMRM-IDA-EPI)掃描方式可以在高靈敏度分析的同時(shí)獲得化合物的二級(jí)質(zhì)譜,因此其在同時(shí)篩查和定量分析方面具有優(yōu)勢(shì)[23]。

針對(duì)以上情況,本研究致力于結(jié)合UPLC-Q-TRAP/MS技術(shù),建立指印中常見(jiàn)36種降壓藥的檢驗(yàn)方法,探索指印化學(xué)分析用于藥物測(cè)定的潛力,提升指印證據(jù)價(jià)值,為指印中藥物檢驗(yàn)在法庭科學(xué)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

表 1 36種降壓藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS parameters of the 36 hypotensive drugs

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC分析使用LC-30A UPLC儀器(日本Shimadzu公司)進(jìn)行,配備兩個(gè)LC-30A泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱室和脫氣機(jī)。使用具有Turbo VTM離子源的5500 Q-TRAP/MS質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)SCIEX公司)進(jìn)行質(zhì)譜分析。DHC-16500臺(tái)式高速離心機(jī)(澳洲Kewlab公司); Vortex-Genie2可調(diào)速渦旋混合器(美國(guó)SI公司);超聲振蕩器(美國(guó)Cole-Parmer公司);電子分析天平(0.01 mg～220 g,德國(guó)Satorius公司)。

36種降壓藥對(duì)照品(見(jiàn)表1),純度均大于97%,購(gòu)自中國(guó)陶術(shù)、源葉、阿拉丁公司及中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(均為HPLC級(jí),美國(guó)Fisher Scientific公司);實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q去離子水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備。

9 cm定性濾紙(杭州新華紙業(yè)公司);一次性氯化聚乙烯(CPE)手套(美國(guó)Ammex公司);移液器和2 mL離心管(德國(guó)Eppendorf公司)。

本研究通過(guò)了公安部物證鑒定中心科研倫理委員會(huì)的審查,并獲得了志愿者的知情同意。實(shí)驗(yàn)所用的空白指印采集于4名健康志愿者:志愿者1,女,27歲;志愿者2,男,22歲;志愿者3,女,23歲;志愿者4,女,24歲。4名志愿者在實(shí)驗(yàn)期間均未服用任何藥物,對(duì)其指印樣品進(jìn)行了36種降壓藥的篩查,結(jié)果均為陰性。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.00 mg標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇溶解定容至10.00 mL,得到質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取適量每種單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇稀釋定容,得到質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃下避光儲(chǔ)存。系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用甲醇連續(xù)稀釋得到,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品的制備

使用3×3 cm的方形定性濾紙片采集指印,志愿者將手洗凈晾干后戴一次性CPE手套2 min,將指頭以中等力度捺印在承痕客體上,停留30 s,并標(biāo)記捺印指印的位置。不同添加量的空白加標(biāo)指印樣品通過(guò)在空白指印區(qū)域加入25.00 μL適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液得到。

1.4 樣品前處理

用剪刀將印有指印的濾紙剪碎,置于2 mL塑料離心管中,加入0.50 mL甲醇,渦旋混合1 min,超聲振蕩3 min,取出后以12 000 r/min離心5 min,取上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC?BEH C18柱(100 mm×3.0 mm, 1.7 μm),柱溫:40 ℃,流動(dòng)相:A相為0.01%甲酸水溶液,B相為甲醇,流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～1.5 min, 5%B～35%B; 1.5～6.0 min, 35%B～95%B; 6.0～8.0 min, 95%B; 8.0～8.1 min, 95%B～5%B; 8.1～11.0 min, 5%B。進(jìn)樣量:5 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;離子源溫度:550 ℃;掃描方式:正離子和負(fù)離子模式同時(shí)切換掃描;檢測(cè)方式:SMRM-IDA-EPI模式;噴霧電壓:5 500 V(ESI+)/-4 500 V(ESI-);霧化氣壓力:379 225 Pa;氣簾氣壓力:241 325 Pa;輔助氣壓力:341 750 Pa;碰撞氣壓力:48 265 Pa;化合物射入電壓和碰撞室射出電壓在正離子模式下為10 V和17 V,在負(fù)離子模式下為-10 V和-15 V。其他質(zhì)譜參數(shù),包括保留時(shí)間、定量與定性離子對(duì)、去簇電壓(DP)及碰撞能量(CE)見(jiàn)表1。儀器控制、數(shù)據(jù)采集和處理使用SCIEX OS 1.5軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

查閱化合物的分子式,在電噴霧電離源,正、負(fù)離子模式下,先用針泵進(jìn)樣50.00 μg/L各目標(biāo)化合物的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用一級(jí)質(zhì)譜全掃描(Q1 Scan)確定母離子的質(zhì)荷比;使用二級(jí)離子掃描(Product Ion Scan),設(shè)定CE初始值為5 eV,以5 eV為步長(zhǎng)自動(dòng)調(diào)節(jié)CE,得到至少2～3個(gè)響應(yīng)值高的特征子離子的質(zhì)荷比,組建定量與定性分析離子對(duì),優(yōu)化CE和DP,以得到的參數(shù)初步建立多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)質(zhì)譜分析方法。優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

液相色譜條件在實(shí)現(xiàn)良好的色譜行為方面起著關(guān)鍵作用[24]。實(shí)驗(yàn)選用ACQUITY UPLC?BEH C18柱(100 mm×3.0 mm, 1.7 μm),實(shí)現(xiàn)了36種藥物良好的分離效果。以ESI源為電離源的質(zhì)譜分析需要對(duì)溶液中的樣品進(jìn)行電離,因此流動(dòng)相的組成不僅會(huì)影響化合物的色譜峰形和保留時(shí)間,還會(huì)影響其離子化效率,進(jìn)而影響檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)比較了水和乙腈、水和甲醇、5 mmol/L甲酸銨水溶液和甲醇、0.01%甲酸水溶液和甲醇、0.1%甲酸水溶液和甲醇5種流動(dòng)相組成。結(jié)果表明,使用乙腈作為有機(jī)相時(shí)化合物的分離效果和靈敏度沒(méi)有使用甲醇時(shí)好;在流動(dòng)相中加入甲酸銨后,樣品中許多組分峰形較差且靈敏度較低;加入0.01%甲酸后分析靈敏度得到了提高,且分離效果和峰形較好;而加入0.1%甲酸時(shí)靈敏度下降。因此最終選擇0.01%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化,使用上述色譜條件36種化合物在11.0 min內(nèi)獲得了良好的色譜峰形和分離效果以及優(yōu)異的靈敏度。以此色譜分析條件運(yùn)行MRM方法,確定各待測(cè)化合物的保留時(shí)間,建立SMRM分析方法。SMRM是在MRM分析的基礎(chǔ)上,根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間設(shè)定窗口進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,在分析目標(biāo)物數(shù)量較多的情況下,可以提高檢測(cè)效率和靈敏度。36種藥物的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 36種降壓藥的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of the 36 hypotensive drugs

2.3 EPI譜庫(kù)的建立

UPLC-MS/MS常規(guī)的MRM檢測(cè)方式,通過(guò)離子對(duì)的保留時(shí)間、質(zhì)荷比、相對(duì)豐度比進(jìn)行定性。本研究采用Q-TRAP/MS系統(tǒng)的SMRM-IDA-EPI掃描方式,在此基礎(chǔ)上增加了二級(jí)譜庫(kù)的匹配用于定性分析,可有效降低結(jié)果的假陽(yáng)性率。該方法在SMRM分析的基礎(chǔ)上,以預(yù)定義的信息關(guān)聯(lián)采集標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)觸發(fā)增強(qiáng)子離子二級(jí)質(zhì)譜掃描,其離子阱富集功能可獲得高靈敏度的二級(jí)質(zhì)譜信息[25]。分析在低(20 eV)、中(35 eV)、高(50 eV)3個(gè)碰撞能量下進(jìn)行。對(duì)36種降壓藥的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行掃描,建立EPI二級(jí)譜庫(kù)。將樣品分析時(shí)獲得的EPI二級(jí)譜圖與譜庫(kù)進(jìn)行匹配,相似程度越高,定性結(jié)果的準(zhǔn)確度越高。該方法通過(guò)一次進(jìn)樣同時(shí)滿足了高靈敏度的定量分析和基于譜庫(kù)的定性篩查需求。

2.4 前處理方法的優(yōu)化

法庭科學(xué)毒物分析領(lǐng)域常用的生物檢材前處理方法包括沉淀蛋白法、液液萃取、固相萃取、分散固相微萃取、低共熔溶劑萃取以及QuEChERS前處理方法等[26]。其中有機(jī)溶劑沉淀蛋白法具有操作簡(jiǎn)單快速、成本較低且不易引入影響檢測(cè)的物質(zhì)和破壞待測(cè)物結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)?？紤]到指印中藥物的含量較少,以及實(shí)際工作中快速高效的分析要求,本研究采用了操作較為簡(jiǎn)便的有機(jī)溶劑沉淀蛋白前處理方法。

使用濾紙采集的指印,采用直接剪取法進(jìn)行提取,可減少提取過(guò)程中帶來(lái)的損失,實(shí)際案件中由于客觀因素?zé)o法進(jìn)行剪取的,可以采用部分浸泡的方法進(jìn)行提取。有機(jī)溶劑沉淀蛋白法最常用的沉淀劑是甲醇和乙腈。在添加水平為2.50 ng/fingerprint時(shí),考察了0.50 mL甲醇、乙腈、50%甲醇水溶液作為沉淀劑時(shí)的提取效果。結(jié)果表明,甲醇和乙腈作為沉淀劑時(shí)的提取效果差別不大,且較50%甲醇水溶液作為沉淀劑時(shí)的提取效果好,由于甲醇毒性較乙腈低,因此選擇使用甲醇作為沉淀劑。另外對(duì)比了使用0.50 mL和0.25 mL甲醇作為沉淀劑時(shí)的提取效果,沉淀劑用量為0.50 mL時(shí)提取效果較好,因而最終選用0.50 mL的甲醇作為沉淀劑。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

按照1.3節(jié)所述獲得空白樣品,并在空白指印區(qū)域添加適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液25.00 μL,得到添加量為0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、12.50、25.00、50.00 ng/fingerprint的樣品,按照前述實(shí)驗(yàn)條件和方法進(jìn)行測(cè)定。以添加水平(x, ng/fingerprint)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。以離子對(duì)色譜峰信噪比(S/N)≥3和10時(shí)目標(biāo)物的含量為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,指印中36種藥物在0.05～50.00 ng/fingerprint范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.99, LOD為0.001～0.045 ng/fingerprint, LOQ為0.002～0.050 ng/fingerprint,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有較高的靈敏度,可以滿足實(shí)際測(cè)定的要求。

2.5.2基質(zhì)效應(yīng)

指印中存在膽固醇、脂肪酸、氨基酸、角鯊烯等復(fù)雜物質(zhì),因此需要考察基質(zhì)效應(yīng)(ME),以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。按照1.4節(jié)中所述前處理方法取空白指印進(jìn)行甲醇沉淀蛋白的操作步驟,取離心后的上清液作為空白基質(zhì)溶液,用空白基質(zhì)溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,得到目標(biāo)物的峰面積(A),同時(shí)測(cè)定相同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的峰面積(B),根據(jù)ME=A/B×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。分別計(jì)算藥物添加水平為0.25、2.50、25.00 ng/fingerprint時(shí)的基質(zhì)效應(yīng),每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。當(dāng)ME<100%時(shí),說(shuō)明基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物有抑制作用,當(dāng)ME>100%時(shí),則存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,指印中所有目標(biāo)藥物的基質(zhì)效應(yīng)為79.0%～119.2%,說(shuō)明本研究采用的方法基質(zhì)效應(yīng)較弱,定量分析結(jié)果具有準(zhǔn)確性和可靠性。

2.5.3回收率和精密度

在空白指印中分別添加0.25、2.50和25.00 ng/fingerprint的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述前處理方法進(jìn)行回收試驗(yàn),得到目標(biāo)物的峰面積(C),根據(jù)回收率=C/A×100%進(jìn)行計(jì)算,每個(gè)加標(biāo)水平在1 d內(nèi)平行測(cè)定5次,回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,得到日內(nèi)精密度(intra-day RSD),連續(xù)進(jìn)樣5 d,計(jì)算日間精密度(inter-day RSD),相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,指印中36種藥物的回收率為79.3%～116.2%,日內(nèi)精密度為0.2%～18.3%,日間精密度為1.6%～19.1%,說(shuō)明該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性良好,證明了其在指印中降壓藥分析中的可靠性和實(shí)用性。

表 2 36種降壓藥的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of the 36 hypotensive drugs

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

本研究共招募87名患有高血壓并服用降壓藥的志愿者,其中男性40人,女性47人,涵蓋不同年齡段、不同服藥時(shí)間和不同服藥量,樣本具有一定的代表性。志愿者將手洗凈、晾干后戴一次性CPE手套2 min,將指頭以中等力度捺印在剪裁好的濾紙上,停留30 s,使指印汗液轉(zhuǎn)移到承痕客體上,保證成功采樣。每個(gè)指印樣品嚴(yán)格按照相同的方法采集,保證樣品的穩(wěn)定性。按照本文建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行提取分析,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。通過(guò)待測(cè)物離子對(duì)的質(zhì)荷比、保留時(shí)間、相對(duì)豐度比以及EPI譜庫(kù)的匹配情況進(jìn)行定性分析。志愿者服用的藥物、服藥人數(shù)及指印中檢出其所服用藥物的信息見(jiàn)表4(部分志愿者同時(shí)服用2種降壓藥)。根據(jù)表中數(shù)據(jù),指印中降壓藥的檢出率可達(dá)77%以上。對(duì)于未檢出的樣品,可能與指印中的汗液量和受試者的藥代動(dòng)力學(xué)差異有關(guān)[27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,藥物的排泄可通過(guò)皮膚的汗腺和/或皮脂腺發(fā)生,本研究建立的方法適用于指印中降壓藥的檢驗(yàn)。

表 3 36種降壓藥的基質(zhì)效應(yīng)和加標(biāo)回收率(n=5)Table 3 Matrix effects and spiked recoveries of the 36 hypotensive drugs (n=5)

表 4 志愿者服用藥物、服藥人數(shù)和指印中藥物檢出人數(shù)Table 4 Hypotensive drugs taken by volunteers, the numbers of people taking drugs and detected drugs from fingerprints

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-Q-TRAP/MS檢測(cè)指印中36種降壓藥的方法。該方法操作簡(jiǎn)單,分析速度快,具有較高的靈敏度和選擇性。這種方法通過(guò)對(duì)指印進(jìn)行化學(xué)分析來(lái)測(cè)定藥物,具有非侵入性的優(yōu)點(diǎn),且樣品收集及制備程序簡(jiǎn)單,是可用于藥物監(jiān)測(cè)的新方法。該方法還進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)指印供體進(jìn)行特征刻畫的研究,為指印中藥物檢測(cè)在法庭科學(xué)中的應(yīng)用及現(xiàn)場(chǎng)痕量證據(jù)的深度挖掘提供了技術(shù)支持。