王雪婷, 李靜靜, 姜 珊, 沈偉健, 王毅謙, 顧 強(qiáng)

(1. 南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 江蘇 南京 210001; 2. 張家港海關(guān)綜合技術(shù)中心, 江蘇 張家港 215600)

氯丙二醇酯(monochloropropanediol esters, MCPDEs)是氯丙二醇與脂肪酸的酯化產(chǎn)物,其中3-氯丙二醇酯(3-monochlorpropanediol esters, 3-MCPDEs)在胰酯酶作用下會(huì)釋放出具有潛在致癌性的3-氯丙二醇(3-MCPD)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道,在未精煉的原油中幾乎不含有3-MCPDEs(<0.05 mg/kg),然而在精煉油中3-MCPDEs的含量卻會(huì)顯著增加(0.2～20 mg/kg)[2]?？s水甘油酯(glycidyl esters, GEs)是縮水甘油與脂肪酸的酯化產(chǎn)物,是制備3-MCPDEs的前體物,本身并不具有致癌性。研究表明,精煉油中10%～60%的3-MCPDEs是由GEs轉(zhuǎn)化而來(lái)的[3]。現(xiàn)如今3-MCPDEs和GEs已成為繼反式脂肪酸之后油脂精煉加工過(guò)程中產(chǎn)生的新型潛在危害因子[4]。到目前為止,我國(guó)尚未設(shè)立油脂中MCPDEs和GEs的限量值,但2018年歐盟發(fā)布的(EU)2018/290號(hào)法規(guī)已對(duì)油脂中GEs總量給出了界限值。為嚴(yán)格控制加工油脂中MCPDEs和GEs的含量水平,確保食用植物油的安全,建立可靠的分析方法是首要工作。

現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外已建立了多種分析方法測(cè)定3-MCPDEs[5-10],但2-氯丙二醇酯(2-monochlorpropanediol esters, 2-MCPDEs)和GEs的定量分析方法發(fā)展相對(duì)滯后。已報(bào)道的GEs檢測(cè)方法有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11,12](直接法)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-19](間接法),其中間接法只需一個(gè)單一的酯類標(biāo)準(zhǔn)品就可測(cè)得GEs總量因而更適合于常規(guī)分析。在使用間接法測(cè)定MCPDEs和GEs的研究中,根據(jù)酯交換反應(yīng)使用的催化劑類型不同,間接法又分為堿催化間接法和酸催化間接法。堿催化間接法由于酯交換反應(yīng)時(shí)間快,檢驗(yàn)周期短,已有很多文獻(xiàn)報(bào)道,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和海關(guān)總署發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也都采用了此法,但是在堿性介質(zhì)中3-MCPD、2-氯丙二醇(2-MCPD)和3-溴丙二醇(3-MBPD)很容易發(fā)生副反應(yīng)生成游離態(tài)的縮水甘油,進(jìn)而會(huì)造成過(guò)低評(píng)估樣品中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs總量,影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[20-22]。此外,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)3類物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定;行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)最終結(jié)果將GEs的總量以3-MCPD計(jì)也與歐盟限量要求不符。基于上述原因,本方法以美國(guó)油脂化學(xué)協(xié)會(huì)AOCS Cd 29a-13方法[23]為基礎(chǔ),增加了2-MCPDEs的同位素內(nèi)標(biāo),選取了響應(yīng)高且無(wú)干擾的監(jiān)測(cè)離子,并通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件建立了一種酸性酯交換間接分析法,它可以同時(shí)對(duì)植物油中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的總量進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析,且定量方式完全符合歐盟要求。在試樣制備過(guò)程中,我們使用酸性酯交換反應(yīng)有效避免3-MCPD、2-MCPD和3-MBPD副反應(yīng)的發(fā)生;通過(guò)對(duì)溴化反應(yīng)溫度、溴化反應(yīng)時(shí)間、衍生化試劑用量等前處理?xiàng)l件的優(yōu)化,取得較好的效果。該方法重現(xiàn)性好,準(zhǔn)確度高,適用于實(shí)驗(yàn)室對(duì)植物油中這3類加工污染物的常規(guī)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent科技有限公司); SQP Quintix224-1CN電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司); KH-500SP超聲波振蕩器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); BS-06恒溫水浴搖床(韓國(guó)jeiotech公司); WH-3渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠); Auto Vap S60氮吹儀(美國(guó)ATR公司)。

正己烷、丙酮、甲醇、四氫呋喃、甲苯均為色譜純(美國(guó)Fisher公司);溴化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、硫酸均為優(yōu)級(jí)純(國(guó)藥集團(tuán));苯基硼酸(phenyl boronic acid, PBA,純度97%,美國(guó)Sigma公司);實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯(純度99.6%,英國(guó)LGC公司), D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯(純度98%,加拿大TRC公司), 2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯(純度98%,加拿大TRC公司), D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯(純度98.2%, BePure公司),棕櫚酸縮水甘油酯(純度98.0%, BePure公司), D5-棕櫚酸縮水甘油酯(純度96%,加拿大TRC公司)。

112批油脂樣品來(lái)源于本地超市及電商銷售平臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品53.14 mg、D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品51.27 mg、2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品58.21 mg、D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品56.13 mg、棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品42.18 mg、D5-棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品40.15 mg至6個(gè)10 mL棕色容量瓶中,以甲苯為溶劑配制質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(以對(duì)應(yīng)的氯丙二醇、氘代氯丙二醇、縮水甘油和氘代縮水甘油計(jì)), -20 ℃避光保存,有效期2年。

將氯丙二醇酯和縮水甘油酯單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L)用甲苯稀釋配制成10 mg/L(以對(duì)應(yīng)的氯丙二醇和縮水甘油計(jì))的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,-20 ℃避光保存,有效期1年。

將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L)用甲苯稀釋配制成10 mg/L(以對(duì)應(yīng)的氘代氯丙二醇和氘代縮水甘油計(jì))的混合內(nèi)標(biāo)工作液,-20 ℃避光保存,有效期1年。

1.2.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.25 g(精確至0.000 1 g)植物油樣品于10 mL螺口玻璃試管中,準(zhǔn)確加入25 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液,再加入2 mL四氫呋喃,渦旋溶解,作為待反應(yīng)液。

向待反應(yīng)液中加入30 μL酸性溴化鈉溶液(溴化鈉3 mg/mL,含5%(v/v)硫酸),旋緊蓋子,渦旋混合,在50 ℃水浴反應(yīng)15 min;加入3 mL碳酸氫鈉溶液(6 g/L)終止反應(yīng)。隨后加入2 mL正己烷,渦旋振蕩15 s,靜置,取上清液于另一10 mL螺口玻璃試管中,再用正己烷重復(fù)提取1次,合并提取液,40 ℃氮吹至近干,加入1 mL四氫呋喃溶解殘?jiān)?作為待凈化液。

向待凈化液中加入1.8 mL硫酸-甲醇溶液(1.8%, v/v),渦旋混合10 s,旋緊瓶蓋,置于40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)16 h。加入0.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng),渦旋10 s,氮吹除去有機(jī)溶劑。再向剩余液中依次加入2 mL硫酸鈉溶液(200 g/L), 2 mL正己烷,渦旋混合10 s,靜置分層后,棄去上層正己烷,再用正己烷重復(fù)萃取1次,棄去上層正己烷,得到下層凈化液備用。

向凈化液中加入300 μL飽和苯基硼酸溶液,渦旋10 s后,于室溫下超聲5 min。取出后,加入2 mL正己烷,渦旋10 s,靜置分層后,取上層正己烷至另一潔凈的玻璃試管中。再用正己烷重復(fù)提取1次,合并提取液,40 ℃氮吹至近干。用1 mL正己烷溶解殘?jiān)?渦旋10 s,經(jīng)0.45 μm尼龍微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3分析條件

GC條件 DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×1 μm);進(jìn)樣口溫度280 ℃;升溫程序?yàn)?0 ℃保持0.5 min,以20 ℃/min速率升溫至180 ℃,保持0.5 min,再以5 ℃/min速率升溫至200 ℃,保持4 min,最后以40 ℃/min速率升溫至300 ℃,并保持4 min;進(jìn)樣方式為脈沖不分流;進(jìn)樣量1 μL。

MS條件 電子轟擊離子源(EI);電離能量70 eV;離子源溫度280 ℃;四極桿溫度150 ℃,傳輸線溫度280 ℃;掃描方式為選擇離子掃描(SIM);溶劑延遲6 min;定時(shí)事件14 min MS關(guān)閉;3種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和定量、定性離子見(jiàn)表1。

表 1 3種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和定量、定性離子Table 1 Retention times, quantitative and qualitative ions of the three target compounds and their internal standards (IS)

2 結(jié)果與討論

2.1 3種目標(biāo)化合物儀器條件的建立

本方法的建立是基于在酸性條件下,GEs的環(huán)氧環(huán)易受親核試劑的攻擊而被打開(kāi),生成單?；视蜆臃肿?。由于溴化物與氯化物的相似性較高,在質(zhì)子溶劑中反應(yīng)活性較大,當(dāng)親核試劑是含溴離子的鹵化物時(shí),GEs會(huì)轉(zhuǎn)化為2-MBPD單酯或3-MBPD單酯。已有研究表明,GEs上脂肪酸鏈引起的空間位阻效應(yīng)使其以形成3-MBPD單酯為主(3-MBPD與2-MBPD的信號(hào)響應(yīng)比在13～15之間)[23]。因2-MCPD、3-MCPD和3-MBPD具有相似的分子結(jié)構(gòu),我們可以使用同一種衍生試劑——苯基硼酸,實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中2-MCPDEs、3-MCPDEs和GEs的同步定量分析。

將3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯、2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯及棕櫚酸縮水甘油酯用甲苯配制成10 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,D5-3-氯-1,2-丙二醇棕櫚酸雙酯,D5-2-氯-1,3-丙二醇硬脂酸雙酯及D5-棕櫚酸縮水甘油酯用甲苯配制成5 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)鹵化、水解、衍生后,用全掃描方式進(jìn)行測(cè)定,以此獲得各目標(biāo)化合物的特征離子。3種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)在GC-MS分析條件下,經(jīng)全掃描模式分析得到相應(yīng)的總離子流圖和質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖 1 3種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)的總離子流圖和質(zhì)譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms and mass spectra of the three target compounds and their IS The concentrations of the three target substances were 10 mg/L, and the concentrations of their IS were 5 mg/L.

從圖1中可以看出,3種目標(biāo)化合物在該GC-MS分析條件下響應(yīng)及分離度良好;選取響應(yīng)高且無(wú)干擾的監(jiān)測(cè)離子,可以降低噪聲和其他干擾效應(yīng),提高檢測(cè)靈敏度,在選擇離子監(jiān)測(cè)模式下,3種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)的定量和定性離子見(jiàn)表1。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1溴化反應(yīng)條件的優(yōu)化

Hrncirik等[24]已詳細(xì)研究了硫酸和親核試劑溴化鈉濃度對(duì)縮水甘油酯轉(zhuǎn)化成3-MBPD單酯效率的影響,本方法直接引用其結(jié)果,僅考察了溴化反應(yīng)溫度(30、40、50、60和70 ℃)和溴化反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20和25 min)對(duì)縮水甘油酯轉(zhuǎn)化成3-MBPD單酯效率的影響。準(zhǔn)備待測(cè)樣品10份,在樣品中加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液,在不同的溴化反應(yīng)溫度和溴化反應(yīng)時(shí)間下,按照1.2.2節(jié)進(jìn)行處理,內(nèi)標(biāo)D5-3-MBPD-PBA的峰面積結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 (a)溴化反應(yīng)溫度和(b)溴化反應(yīng)時(shí)間對(duì)植物油樣品中 內(nèi)標(biāo)D5-棕櫚酸縮水甘油酯轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 2 Effect of (a) bromination reaction temperature and bromination reaction time (b) on the conversion efficiency of IS D5-glycidyl palmitate in vegetable oil samples

從圖2中可以發(fā)現(xiàn),較高的溫度和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間都會(huì)對(duì)縮水甘油酯的轉(zhuǎn)化效率造成影響。為獲得縮水甘油酯的最佳轉(zhuǎn)化效率,最終我們選取50 ℃下反應(yīng)15 min作為溴化反應(yīng)的最佳條件。

2.2.2衍生化反應(yīng)條件的優(yōu)化

3-MBPDEs、3-MCPDEs、2-MCPDEs及其同位素內(nèi)標(biāo)物經(jīng)硫酸-甲醇水解后分別生成了3-MBPD、D5-3-MBPD、3-MCPD、D5-3-MCPD、2-MCPD和D5-2-MCPD,再經(jīng)PBA衍生后得到3種目標(biāo)化合物及3種內(nèi)標(biāo)化合物,即3-MBPD-PBA、D5-3-MBPD-PBA、3-MCPD-PBA、D5-3-MCPD-PBA、2-MCPD-PBA和D5-2-MCPD-PBA?？疾炝搜苌噭┑氖褂皿w積(100、200、300、400和500 μL)和衍生化反應(yīng)時(shí)間(5、10、15、20和25 min)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

圖 3 (a)衍生化試劑的使用體積和(b)衍生化反應(yīng)時(shí)間 對(duì)植物油樣品中3種內(nèi)標(biāo)測(cè)定結(jié)果的影響Fig. 3 Effect of (a) volume of derivatization reagent and (b) derivatization reaction time on the determination results of three IS in vegetable oil samples

準(zhǔn)備待測(cè)樣品10份,將樣品中加入500 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液,在衍生化試劑不同使用量和反應(yīng)時(shí)間下,按照1.2.2節(jié)進(jìn)行處理,3種內(nèi)標(biāo)化合物的峰面積結(jié)果見(jiàn)圖3。如圖3a所示,衍生化試劑的用量對(duì)內(nèi)標(biāo)D5-棕櫚酸縮水甘油酯的影響最為明顯,綜合考慮3種內(nèi)標(biāo)的信號(hào)響應(yīng)情況,最終我們選取衍生化試劑用量為300 μL;圖3b顯示,衍生化反應(yīng)時(shí)間對(duì)3種內(nèi)標(biāo)的信號(hào)響應(yīng)值影響較小,在5 min時(shí)衍生化反應(yīng)已基本完成,出于節(jié)約時(shí)間方面考慮,最終選擇衍生化時(shí)間5 min。

2.3 方法學(xué)指標(biāo)考察結(jié)果

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作溶液適量于6個(gè)10 mL螺口玻璃試管中,按1.2.2節(jié)步驟與試樣同時(shí)處理。得到質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為0.25 mg/L,按濃度由低到高的順序進(jìn)樣分析。

以目標(biāo)化合物及其對(duì)應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)的濃度比值為橫坐標(biāo),以目標(biāo)化合物及其對(duì)應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而獲得線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2),見(jiàn)表2。結(jié)果表明,線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999,說(shuō)明目標(biāo)化合物在0.01～0.80 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

以定量離子信噪比(S/N)為3和10時(shí)的響應(yīng)定義方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 3-MCPDEs、2-MCPDEs及GEs的檢出限和定量限分別為25、25、20 μg/kg和75、75、60 μg/kg。

表 2 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients (r2), limits of detection (LODs) and limits of quanti-fication (LOQs) of target compounds CompoundLinear equation r2LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)3-MCPD-PBAy=17.770068x-0.1961560.999825752-MCPD-PBAy=0.391145x+0.0014310.999825753-MBPD-PBAy=0.722427x-0.0077600.99992060 y: peak area ratio of the analyte to the internal standard; x: mass concentration ratio of the analyte to the internal standard.

2.3.2準(zhǔn)確度和精密度

按照前述方法,對(duì)大豆油、菜籽油、葵花籽油和亞麻籽油4種樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn),設(shè)定添加水平為250、500、750 μg/kg,考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見(jiàn)表3。不同基質(zhì)中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的加標(biāo)回收率為89.0%～98.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.05%～7.81%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

2.4 本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定值的比較

采用本文所建立的方法、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB 5009.191-2016)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法(SN/T 5220-2019)測(cè)定了植物油(樣品編號(hào):FAPAS 2662)中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的值,結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知,由于標(biāo)準(zhǔn)方法中使用了甲醇鈉-甲醇溶液進(jìn)行酯鍵斷裂反應(yīng),易造成3-MCPD、2-MCPD和3-MBPD副反應(yīng)的發(fā)生,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性不好且測(cè)定值會(huì)偏低一些。

表 5 實(shí)際樣品中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Detected results of 3-MCPDEs, 2-MCPDEs and GEs in real samples

表 3 3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs在植物油樣品中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 3-MCPDEs, 2-MCPDEs and GEs in vegetable oils (n=6)

表 4 不同方法測(cè)得的植物油中3種目標(biāo)物的含量(n=6)Table 4 Contents of three target substances in vegetable oil by different methods (n=6)

2.5 市售樣品分析評(píng)價(jià)

采用本文建立的方法對(duì)市售的112批植物油,包括大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、芝麻油樣品進(jìn)行分析,在84批樣品中檢出3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs(測(cè)定值范圍見(jiàn)表5),檢出率高達(dá)75%;部分大豆油、菜籽油和芝麻油中GEs含量高出歐盟(EU)2018/290號(hào)法規(guī)中的限量值(GEs≤1 mg/kg),超標(biāo)率分別為9.1%、7.5%和45.5%。

3 結(jié)論

本文所建立的酸性酯交換法既可避免副反應(yīng)的發(fā)生,又可彌補(bǔ)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)法對(duì)3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的缺失。方法分析效率高、準(zhǔn)確度好、重復(fù)性佳,對(duì)我國(guó)植物油中3-MCPDEs、2-MCPDEs和GEs污染水平的控制、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。