江 璠,陳壽珍

(廈門市海滄醫(yī)院婦科,福建 廈門 361000)

慢性盆腔炎(CPID)是由于生殖器官及其周圍組織發(fā)生的慢性炎癥性病變[1]。CPID由于疾病反復(fù)發(fā)作,遷延不愈,可導(dǎo)致患者出現(xiàn)輸卵管不孕、慢性骨盆疼痛以及宮外孕等,對(duì)女性生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響[2]。大血藤又名紅藤,是木通科植物大血藤的干燥藤莖,具有清熱解毒、活血通絡(luò)、祛風(fēng)止痛等作用,對(duì)婦科血瘀諸證以及風(fēng)濕痹痛均有較好的治療作用[3]。為了進(jìn)一步明確大血藤對(duì)慢性盆腔炎的治療作用及其可能的作用機(jī)制,本研究探討分析大血藤煎劑對(duì)慢性盆腔炎大鼠子宮TGF-β/Smads通路的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥材

大血藤購(gòu)于安徽省,經(jīng)鑒定為木通科植物大血藤的藤莖。取大血藤重量的10倍水進(jìn)行藥材提取,提取3次,每次提取時(shí)間為2h,濃縮干燥后粉碎稱重,使用時(shí)用0.5%CMC-Na配置成混懸液。

婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z43020027)

1.2 動(dòng)物

SD雌性大鼠70只,SPF級(jí),體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2012-0001)。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)3d,飼養(yǎng)溫度18～25℃,恒定濕度,動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑及儀器

戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司,H31021724);苯酚(上海阿達(dá)丁生化科技股份有限公司,CAS: 108-95-2);IL-6 ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam,ab234570);TNF-α ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam,ab236712);TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen,10296010);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen,18091050);RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,P0013B);極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,P0018FS);TGF-β1抗體(美國(guó)Abcam,ab229856);TGF-β3抗體(美國(guó)Abcam,ab15537);Smad3抗體(美國(guó)Abcam,ab40854);Smad7抗體(美國(guó)Abcam,ab216428);電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司,BA110S型,萬(wàn)分之一精確度)。

1.4 方法

1.4.1 慢性盆腔炎大鼠造模

使用30mg/kg戊巴比妥鈉靜脈麻醉大鼠,將腹部正中毛剪去,75%酒精消毒,下腹部正中行2cm切口,暴露子宮,從大鼠子宮分岔處,將0.1mL注射器插入子宮腔內(nèi),針頭轉(zhuǎn)向右側(cè)子宮,緩慢推注0.06mL 25%苯酚膠漿,將左側(cè)子宮作為自身對(duì)照,關(guān)閉腹腔,術(shù)區(qū)消毒。

1.4.2 分組及處理

將70只大鼠隨機(jī)分為7個(gè)組,分別為:對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽(yáng)性藥物組。其中對(duì)照組正常飼養(yǎng),假手術(shù)組僅開(kāi)腹和閉腹,不進(jìn)行苯酚膠漿注射。造模成功后,高、中、低劑量組以及陽(yáng)性藥物組分別給予8g生藥/kg、4g生藥/kg、2g生藥/kg以及婦科千金片(1.13g/kg),按照10mL/(kg·d)灌胃,其中假手術(shù)組以及模型組給予等量生理鹽水灌胃,各組大鼠連續(xù)灌胃3周。

1.5 觀察指標(biāo)

于術(shù)后22d,使用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,使用負(fù)壓管于腹主動(dòng)脈取血3～4mL,分離血清。采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-6以及TNF-α表達(dá)水平。

摘取大鼠左側(cè)、右側(cè)子宮,并計(jì)算子宮腫脹率。子宮腫脹率=(致炎側(cè)子宮質(zhì)量-未致炎側(cè)子宮質(zhì)量)/未致炎側(cè)子宮質(zhì)量×100%。

取各組大鼠右側(cè)子宮組織,用生理鹽水清洗后,將其分為兩塊,取其中一塊子宮組織,用錫箔紙包裹后迅速置于-80℃冰箱內(nèi)迅速冰凍,采用RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠子宮組織內(nèi)TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA表達(dá)。采用TRIzol試劑提取組織總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列為:TGF-β1:上游引物5’-CACTCCCGTGGCTTCTGTG-3’,下游引物5’-GGACTGGCGAGCCTTAGTTT-3’;TGF-β3:上游引物5’-GGACTTCGGCCACATCAAGA-3’,下游引物5’-TGATAGGGACGTGGGT CAT-3’;Smad3:上游引物5’-GGGAGACATTTCCACGCTTCG-3’,下游引物5’-CCTTGTAAG CTCCCACGGCTG-3’;Smad7:上游引物5’-CGGAAGTCAAAGAGGGCTGTGT-3’,下游引物5’-CGTCTGGACAGTCTGCAGTT-3’;β-actin:上游引物5’-CCCATCTATGAGGGTTA CGC-3’,下游引物5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。擴(kuò)增結(jié)束后,取反應(yīng)物上機(jī)進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè),以β-actin作為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)。

取另外一塊子宮組織采用Western blot檢測(cè),研碎后采用RIPA蛋白裂解液提取大鼠子宮組織總蛋白,取20μg蛋白上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜,之后5%脫脂奶粉封閉,一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗37℃孵育1h,TBST清洗后,采用ECL試劑盒顯色,曝光、拍照。結(jié)果用目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示,采用ImageJ軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,多組間計(jì)量資料比較采用方差分析,兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮腫脹程度比較

與對(duì)照組及假手術(shù)組比較,其余各組大鼠右側(cè)子宮明顯腫脹(P<0.05),而大血藤高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組子宮腫脹程度較模型組降低(P<0.05),且隨著大血藤藥物濃度的增加,大鼠右側(cè)子宮腫脹度顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠子宮腫脹程度比較

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

與對(duì)照組及假手術(shù)組比較,其余各組大鼠血清IL-6及TNF-α水平均升高(P<0.05),而大血藤高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組大鼠血清IL-6及TNF-α較模型組降低(P<0.05),且隨著大血藤藥物濃度的增加,大鼠血清IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.3 各組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7表達(dá)比較

與對(duì)照組及假手術(shù)組比較,其余各組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白均升高(P<0.05),而大血藤高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.05),且隨著大血藤藥物濃度的增加,大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較

2.4 各組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA比較

與對(duì)照組及假手術(shù)組比較,其余各組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05),而大血藤高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組降低(P<0.05),且隨著大血藤藥物濃度的增加,大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7 mRNA比較

3 討論

盆腔炎癥可表現(xiàn)為一個(gè)局部癥狀,也可同時(shí)累積多個(gè)部位,其中以卵巢炎、輸卵管炎最為常見(jiàn)。盆腔炎主要在性生活活躍期以及有月經(jīng)的婦女中高發(fā),若未得到及時(shí)、徹底的治療,可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)輸卵管異位妊娠、炎性反應(yīng)反復(fù)發(fā)作、慢性盆腔疼痛以及不孕癥等,嚴(yán)重影響女性的生殖健康[4-5]。慢性盆腔炎是由于患者發(fā)生急性盆腔炎后的一種后遺癥,是由于急性盆腔炎后促炎/抗炎因子相互作用,同時(shí)局部免疫調(diào)節(jié)共同參與的引發(fā)的[6]。由于患者機(jī)體免疫系統(tǒng)受到破壞,抗病能力明顯降低,盆腔更容易受到厭氧菌或需氧菌混合感染,導(dǎo)致機(jī)體炎性細(xì)胞浸潤(rùn),進(jìn)一步加重病情,而對(duì)盆腔組織造成影響[7]。目前,西醫(yī)對(duì)于慢性盆腔炎的治療,主要以抗菌藥物治療為主,但是治療療效不佳、治療副作用大,且患者長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥性,而中醫(yī)藥對(duì)于慢性疾病的治療具有標(biāo)本兼治、副作用小等優(yōu)勢(shì)[8]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,盆腔炎發(fā)生主要是由于機(jī)體氣血運(yùn)行不暢、胞宮經(jīng)血受阻,不通則痛,或由于沖任胞宮失于濡養(yǎng),不榮則痛[9]。因此,對(duì)于慢性盆腔炎的治療關(guān)鍵在于“活血化瘀”。大血藤藥性苦、平,歸大腸、肝經(jīng),可清熱解毒,活血止痛,臨床上多用于婦科盆腔炎的治療。為了進(jìn)一步了解大血藤治療慢性盆腔炎的機(jī)制,本研究使用慢性盆腔炎大鼠進(jìn)行研究分析。

IL-6是單核細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的一種炎癥細(xì)胞因子,IL-6可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),造成組織細(xì)胞的進(jìn)一步損傷;TNF-α則是一種可誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫反應(yīng)以及天然免疫反應(yīng)的重要介質(zhì),可激活巨噬細(xì)胞,從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,造模后各組大鼠血清IL-6以及TNF-α水平顯著升高,同時(shí)大血藤煎劑可有效降低慢性盆腔炎模型大鼠子宮腫脹程度以及血清IL-6以及TNF-α表達(dá)水平,提示了慢性盆腔炎模型造成成功,同時(shí)大血藤對(duì)慢性盆腔炎的治療可能通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)以及炎癥因子的表達(dá),調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能有關(guān)。與學(xué)者研究報(bào)道結(jié)果相似[10]。

TGF-β是一類具有多種調(diào)控功能的多肽生長(zhǎng)因子家族,研究顯示,炎癥反應(yīng)可激活機(jī)體內(nèi)TGF-β家族表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞黏連蛋白的合成和分泌,而Smads是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中唯一的底物蛋白。學(xué)者研究報(bào)道顯示[11],在CPID患者中出現(xiàn)TGF-β/Smads信號(hào)通路的異常表達(dá),提示TGF-β/Smads通路參與到了CPID疾病的進(jìn)展中。本研究結(jié)果顯示,大血藤高、中、低劑量組及陽(yáng)性藥物組大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組降低,且隨著大血藤藥物濃度的增加,大鼠子宮TGF-β1、TGF-β3、Smad3、Smad7蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量降低。提示大血藤對(duì)于慢性盆腔炎大鼠的治療,可能與抑制大鼠子宮TGF-β/Smads通路表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,大血藤煎劑可有效降低慢性盆腔炎大鼠子宮腫脹,其作用機(jī)制可能包括抑制大鼠及炎癥反應(yīng)以及抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路。