張基榮,蔣昆霞,許 文*,林 羽,徐 偉,吳長(zhǎng)輝

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122; 2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新與中心,福建 福州 350122; 3. 福建仙芝樓科技有限公司,福建 南平 350002)

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.) Karst或紫芝GanodermasinenceZhao, Xu et Zhang的干燥子實(shí)體,性甘,平,具有治療心神不寧,失眠心悸等功效[1]。靈芝含有多類成分,三萜酸類為其主要有效成分之一,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),靈芝中的三萜酸類成分具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗菌[5]等作用。福建靈芝作為全國(guó)靈芝的主產(chǎn)區(qū)之一,具有悠久的藥用、食用歷史,是福建地區(qū)重要的道地藥材之一,福建靈芝以武夷山脈的南平為主要種植基地,2021年福建省靈芝種植總面積超2000公頃,產(chǎn)品遠(yuǎn)銷全國(guó)各地[6]。

中藥材的追溯,目前國(guó)家出臺(tái)了系列的文件工作,產(chǎn)地的追溯與道地藥材的道地性以及優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)相關(guān)[7],建立中藥產(chǎn)品從種質(zhì)種源、種植生產(chǎn)、采收加工、倉(cāng)儲(chǔ)運(yùn)輸、市場(chǎng)銷售的全過程質(zhì)量追溯是目前保障藥材質(zhì)量的重要方法[8]。2012年國(guó)家就頒布《關(guān)于開展中藥材流通追溯體系建設(shè)試點(diǎn)的通知》,2015年,國(guó)務(wù)院發(fā)布的《關(guān)于加快推進(jìn)重要產(chǎn)品追溯體系建設(shè)的意見》[9];2019、2020年國(guó)家科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)將中藥材質(zhì)量追溯要求列入研究指南;2021年,福建省食品藥品監(jiān)督管理局《福建省規(guī)范中藥材產(chǎn)地趁鮮加工工作指導(dǎo)意見(試行)》將福建靈芝納入中藥材質(zhì)量追溯體系建設(shè);2022年,福建省藥監(jiān)局發(fā)布《關(guān)于推進(jìn)中藥飲片信息化追溯體系建設(shè)工作的通知》,力求中藥飲片全過程質(zhì)量追溯[10]。因此,構(gòu)建福建靈芝藥材的質(zhì)量追溯方法對(duì)于高品質(zhì)靈芝藥材的全鏈條質(zhì)量追溯具有重要意義。然而,目前針對(duì)福建靈芝同其他地區(qū)靈芝的質(zhì)量溯源研究比較較少,課題組汪麗娜采用高效液相指紋圖譜方法結(jié)合PCA、OPLS-DA等化學(xué)計(jì)量學(xué)開展對(duì)福建靈芝的檢測(cè),并對(duì)比了福建靈芝同其他地區(qū)靈芝中藥指紋圖譜差異性[11],發(fā)現(xiàn)靈芝烯酸D是差異性成分,課題組進(jìn)一步采用薄層色譜法分析發(fā)現(xiàn)福建靈芝及其他產(chǎn)地的靈芝的差異性鑒別成分為靈芝烯酸D,即靈芝烯酸D薄層斑點(diǎn)在福建靈芝中顯色明顯,但是從含量上能否用于產(chǎn)地的追溯尚未見研究。

目前針對(duì)靈芝烯酸D的測(cè)定方法主要包括高效液相色譜(HPLC)法[12,13]和HPLC-MS質(zhì)譜法[14-16],但是現(xiàn)有的文獻(xiàn)的研究均鮮有涉及福建靈芝的樣品,相關(guān)建立的方法在前期用于福建靈芝時(shí)存在著靈敏度低、色譜峰分離度不佳、分析時(shí)間較長(zhǎng)等問題。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的快速發(fā)展,UPLC-QqQ-MS法在中藥含量測(cè)定分析方面應(yīng)用廣泛,具有分析靈敏、快速的特點(diǎn)[17]。因此,本文采用UPLC-QqQ-MS法,優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件,構(gòu)建福建靈芝中靈芝烯酸D成分的含量測(cè)定方法,并比較福建靈芝與吉林、浙江、安徽三個(gè)不同產(chǎn)區(qū)赤芝靈芝烯酸D的含量差異,為福建靈芝質(zhì)量溯源提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料

1.1 藥材

靈芝藥材收集于福建(批號(hào):S1～S4)、吉林(批號(hào):S5～S8)、浙江(批號(hào):S9～S12)、安徽(批號(hào):S13～S16)地區(qū),16批靈芝藥材標(biāo)本經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室范世明正高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.) Karst的干燥子實(shí)體。

1.2 試劑

對(duì)照品靈芝烯酸D,實(shí)驗(yàn)室自制,純度大于98%;地塞米松作為內(nèi)標(biāo),批號(hào):100318-2019014購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院,甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司);Milli-Q超純水(美國(guó)Millipore公司);其余試劑均為分析純。

圖1 靈芝烯酸D和內(nèi)標(biāo)(地塞米松)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1.3 儀器和試劑

ACQUITY UPLC I-Class串聯(lián)Xevo-TQS型超高效(UPLC)液相-三重四級(jí)桿(QQQ)質(zhì)譜(美國(guó)Waters公司);EX225DZH/AD型十萬分之一精密自動(dòng)分析天平(美國(guó)OHAUS公司);KQ-500DE型臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);M100型萊茲研磨儀(德國(guó)萊茲公司),默克merck公司質(zhì)譜級(jí)水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件:采用Waters UPLC CORTECS C18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 1.6 μm)色譜柱,以有機(jī)相乙腈(A)-水相0.1%甲酸水溶液(B)為流動(dòng)相,進(jìn)行梯度洗脫(0～9.5 min, 25%A; 9.5～11.5 min, 25%～31%A; 11.5～16.5 min, 31%A; 16.5～19 min, 31%～43%A),流速0.25 mL/min,柱溫40℃,進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件:ESI多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,毛細(xì)管電壓2.5 KV,錐孔電壓3.00 V,脫溶劑氣流N2800 L·h-1,脫溶劑溫度500℃,錐孔氣流N250 L·h-1,離子源溫度150℃,Extractor 3.00 V,碰撞氣體氬氣。靈芝烯酸D、內(nèi)標(biāo)物的MS參數(shù)見表1?？瞻兹軇?、靈芝烯酸D、地塞米松(IS)與靈芝樣品MRM離子流圖,見圖2。

表1 靈芝烯酸D質(zhì)譜參數(shù)

圖2 空白溶劑(A)、對(duì)照品(B)與S1批次福建靈芝樣品(C)的離子流色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取靈芝烯酸D的對(duì)照品適量用甲醇溶解制備成濃度分別為1.31mg/mL的對(duì)照品母液,精密移取靈芝烯酸D對(duì)照品母液,加50%甲醇制成靈芝烯酸D濃度為131 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備:精密稱取內(nèi)標(biāo)物地塞米松適量,加入適量甲醇制備成1.71 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液,精密量取地塞米松對(duì)照品用50%甲醇稀釋,得到質(zhì)量濃度為855 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取靈芝樣品粗粉約1.0 g置具塞瓶中,精密移入50 mL的95%乙醇后進(jìn)行提取具塞瓶稱重,后超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)45 min,放冷之后提取具塞瓶再次稱重,用提取的95%乙醇溶劑進(jìn)行減失揮發(fā)重量的補(bǔ)足,搖勻,16900 r/min離心10 min,0.22 μm微膜濾孔濾過得到續(xù)濾液中按1∶1(200∶200 μL)加入內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行測(cè)定。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,用50%甲醇逐級(jí)稀釋,加入地塞米松內(nèi)標(biāo)液,即得用于繪制線性曲線的不同濃度靈芝烯酸D對(duì)照液,按上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件下檢測(cè),積分靈芝烯酸D的峰面積和內(nèi)標(biāo)地塞米松的峰面積。以靈芝烯酸D與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)對(duì)靈芝烯酸D的濃度(X)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算和線性相關(guān)系數(shù)r的計(jì)算,并以信噪比S/N≥10為定量限(LOQ),S/N≥3為檢測(cè)限(LOD),結(jié)果得到靈芝烯酸D的回歸方程為Y=0.0121X+0.0015(r=0.999 4),線性范圍6.55～6550ng/mL,LOQ與LOD分別為6.55、1.97 ng/mL,表明在考察的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,符合定量分析要求。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,按照上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件下檢測(cè)6次,測(cè)得靈芝烯酸D與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD為2.7%,表明儀器日內(nèi)精密度RSD符合液相-質(zhì)譜檢測(cè)要求;連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣(n=3)測(cè)定,靈芝烯酸D與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD為1.8%,表明儀器日間精密度RSD符合液相-質(zhì)譜檢測(cè)要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取已經(jīng)制備的S1批次的靈芝供試品溶液,分別于0、1、2、4、8、16、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)得不同時(shí)間段靈芝烯酸D與內(nèi)標(biāo)峰面積比值RSD為1.6%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次(S1)福建靈芝藥材樣品6份,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,即取同批次樣品約1.0 g置具塞瓶中,依法加入95%乙醇,制備樣品溶液,并按照上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件下檢測(cè),6份福建靈芝藥材樣品的靈芝烯酸D含量的RSD值為2.5%,結(jié)果表明,所建立的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性試驗(yàn)符合液相-質(zhì)譜聯(lián)用分析要求。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取“2.3.4”項(xiàng)下已測(cè)得含量的福建靈芝藥材(S1)6份,約0.5 g,往6份平行樣中精密加入0.0917 mg(近似1∶1)的靈芝烯酸D,按“2.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定加標(biāo)后測(cè)定量,并根據(jù)回收率公式計(jì)算靈芝烯酸D的回收率,見表2,靈芝烯酸D平均回收率為101.01%,RSD為2.6%,表明其回收率良好。

表2 靈芝烯酸D回收率測(cè)定結(jié)果

2.3.6 樣品含量測(cè)定

取不同批次的赤芝樣品約1.0 g置具塞瓶中,依法加入95%乙醇,分別制備各個(gè)產(chǎn)地靈芝檢測(cè)樣品溶液,并按照上述優(yōu)化的超高效液相色譜以及三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件下檢測(cè),測(cè)定靈芝烯酸D的含量,結(jié)果見表3,福建、吉林、浙江、安徽四個(gè)產(chǎn)地靈芝烯酸D的含量對(duì)比見圖3。

表3 各批次赤芝中靈芝烯酸D的含量(mg/g, n=3)

圖3 福建、吉林、浙江、安徽四個(gè)產(chǎn)地靈芝烯酸D的含量對(duì)比

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

靈芝三萜酸是其獨(dú)特生源途徑下產(chǎn)生的主要藥效物質(zhì)成分,在進(jìn)行色譜條件考察時(shí),本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相體系包括考察了有機(jī)相色譜乙腈和色譜甲醇體系的對(duì)比,包括水相采用超純水、0.1%甲酸水等比較,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水體系色譜峰峰型號(hào)較佳,響應(yīng)較好,故確定為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相體系。進(jìn)一步進(jìn)行靈芝烯酸D色譜條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在靈芝烯酸D離子通道上存在4個(gè)同分異構(gòu)體的色譜峰,并且質(zhì)譜測(cè)試發(fā)現(xiàn)其在質(zhì)譜條件上母離子和子離子相同,因此為使靈芝烯酸D能準(zhǔn)確定量,必須對(duì)四個(gè)同分異構(gòu)體進(jìn)行拆分,確保四個(gè)異構(gòu)體均能分別達(dá)到分離度1.5以上的良好分離,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了流動(dòng)相的組成和梯度流動(dòng)相洗脫的比例,進(jìn)一步對(duì)乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)的比例進(jìn)行優(yōu)化,最終經(jīng)過優(yōu)化的0～9.5 min, 25%A; 9.5～11.5 min, 25%～31%A; 11.5～16.5 min, 31%A; 16.5～19 min, 31%～43%A條件下靈芝烯酸D能與另外3個(gè)同分異構(gòu)體達(dá)到基線分離(分離度>1.5),符合定量分析要求。同時(shí)也提示福建靈芝中三萜類成分比較復(fù)雜,采用液相色譜測(cè)定時(shí),往往難以達(dá)到基線要求。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度,首先本文對(duì)比了正離子模式和負(fù)離子模式,發(fā)現(xiàn)正離子模式下靈芝烯酸D的響應(yīng)優(yōu)于負(fù)離子模式;進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)對(duì)靈芝烯酸D的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行優(yōu)化考察,靈芝中的三萜酸化合物靈芝烯酸D與典型的靈芝酸A相比,主要區(qū)別在于側(cè)鏈的20,22位形成雙鍵,是一類弱極性化合物,在四環(huán)骨架中3、7、11和15位被羥基或羰基取代,易發(fā)生脫水(18 Da)、脫羧(44 Da)等裂解方式。在正離子模式下,靈芝烯酸D母離子為513.28,經(jīng)過四級(jí)桿進(jìn)行碰撞,其質(zhì)譜裂解可以產(chǎn)生多個(gè)子離子如493.30 [M-H-H2O]-,467.28 [M-H-CO2]-,449.27 [M-H-H2O-CO2]-,437.23 [M-H-2CH3-CO2]-,其中子離子493.30 [M-H-H2O]-在質(zhì)譜模式識(shí)別上表現(xiàn)豐度最高,經(jīng)過碎片離子掃描模式(daughter scan)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),子離子493.30 [M-H-H2O]-對(duì)比上述其他子離子,其峰面積也最大,因此將該離子493.30 [M-H-H2O]-作為定量子離子。本研究也進(jìn)一步優(yōu)化了錐孔電壓Cone和碰撞能量CE,即采用不同的錐孔電壓及碰撞能量對(duì)特定的定量離子對(duì)(513.3→495.3)進(jìn)行考察,最終確定了本文使用的質(zhì)譜條件。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

通過UPLC-QqQ-MS法測(cè)定不同產(chǎn)區(qū)中靈芝烯酸D的含量,其中福建靈芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.1653～0.2013 mg/g,吉林赤芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.0172～0.0839 mg/g,浙江赤芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.0201～0.0608 mg/g,安徽赤芝的靈芝烯酸D的含量范圍為0.0127～0.0389 mg/g。福建、吉林、浙江、安徽四個(gè)產(chǎn)地的含量均值分別為0.1801±0.0158、0.0444±0.031、0.0374±0.0176、0.0216±0.0117,經(jīng)Student-t檢驗(yàn),福建靈芝的芝靈芝烯酸D含量顯著高于其他3個(gè)產(chǎn)區(qū),P值均小于0.001,從測(cè)定結(jié)果可以看出以靈芝烯酸D含量為0.1mg/g為限度,可以有效區(qū)分福建和其他不同產(chǎn)地靈芝,提示靈芝靈芝烯酸D的含量可作為福建靈芝質(zhì)量溯源的重要成分。

綜上所述,本研究通過UPLC-QqQ-MS法測(cè)定福建靈芝靈芝烯酸D的含量,方法簡(jiǎn)便、快速,可為福建靈芝的質(zhì)量溯源提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。