龍飄 房盛懿 楊雨瑩 歐陽丹 滿榮勇 曹建中

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，探討苦參治療乙型病毒性肝炎的作用機制，為臨床防治提供指導。方法 通過GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫獲取乙型病毒性肝炎靶點，使用TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM、HERB數(shù)據(jù)庫及查閱相關文獻獲取苦參活性成分及靶點，并利用VENNY作圖取兩者的交集。用Cytoscape、STRING構(gòu)建“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡圖和蛋白互作網(wǎng)絡圖;應用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO和KEGG通路的富集分析;最后通過分子對接和qPCR對上述結(jié)果進行驗證。結(jié)果 乙型病毒性肝炎靶標1827個，苦參活性成分39個，主要成分為刺芒柄花素、8-isopentenyl-kaempferol、（2R）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one、高麗槐素、氧化苦參堿;苦參干預乙型病毒性肝炎共同靶點64個，其核心靶點為IL-6、AKT1、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、TNF和MAPK1;KEGG富集得到通路111條，包括癌癥的通路、乙型肝炎和TNF信號通路;分子對接技術顯示氧化苦參堿與TNF、IL-6結(jié)合，結(jié)合能為-6.1～ -9.8 kcal·mol-1;體外實驗證實氧化苦參堿可下調(diào)HepG2.2.15細胞中TNF-α、IL-6 mRNA的表達，且隨著劑量的增加，下調(diào)趨勢更顯著。結(jié)論 苦參具有多成分、多靶點特性，其主要成分氧化苦參堿可通過激活TNF信號通路，下調(diào)TNF-α、IL-6 mRNA的表達，控制肝臟炎癥，抑制HBV復制。

〔關鍵詞〕 苦參;乙型病毒性肝炎;網(wǎng)絡藥理學;實驗驗證;作用機制

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.02.017

Mechanism study of Kushen （Sophorae Flavescentis Radix） in treating viral hepatitis type

B based on network pharmacology and experimental test

LONG Piao1， FANG Shengyi1， YANG Yuying1， OUYANG Dan1， MAN Rongyong2， CAO Jianzhong1*

（1. Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Department of Neurology & Department of Medical Experimental Center， The First People's Hospital of

Huaihua City， Huaihua， Hunan 418000， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the potential mechanisms of action of Kushen （Sophorae Flavescentis Radix） against viral hepatitis type B， and to provide guidance for improvement in clinical prevention and treatment based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods GeneCards， OMIM， and TTD databases were searched to obtain viral hepatitis type B targets. The active ingredients and targets of Kushen （Sophorae Flavescentis Radix） were searched through TCMSP， BATMAN-TCM， ETCM， HERB databases and related literature. The VENNY was used to map the intersection of the two search results. Cytoscape and STRING were used to construct the "active ingredient-potential target" network diagram and protein-protein interaction network diagram; then the DAVID database was used for the enrichment analysis of GO and KEGG pathways. Finally， molecular docking and qPCR were used to verify the above results. Results There were 1827 targets of viral hepatitis type B and 39 active components of Kushen （Sophorae Flavescentis Radix）， including formononetin， 8-isopentenyl-kaempferol， （2R）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl） chroman-4-one， sophorin， oxymatrine. There were 64 common targets for viral hepatitis type B and Kushen （Sophorae Flavescentis Radix）， including core targets IL-6， AKT1， VEGFA， PTGS2， JUN， CASP3， TNF and MAPK1. KEGG analysis enriched 111 pathways， including cancer pathway， hepatitis type B and TNF signaling pathway. The molecular docking revealed that oxymatrine could bind with TNF and IL-6， with binding energy between -6.1～-9.8 kcal·mol-1. Vitro experiments confirmed that oxymatrine can down-regulate the expression of TNF-α and IL-6 mRNA in HepG2.2.15 cells， and with the increase of the dose， the down-regulation trend was more significant. Conclusion Kushen （Sophorae Flavescentis Radix） has multi-component and multi-target characteristics. Its main component oxymatrine can activate TNF signaling pathways， down-regulate the expression of TNF-α and IL-6 mRNA， control liver inflammation， and inhibit viral hepatitis type B replication.

〔Keywords〕 Kushen （Sophorae Flavescentis Radix）; viral hepatitis type B; network pharmacology; experimental test; mechanism of action

乙型病毒性肝炎（簡稱“乙肝”）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）感染引起，主要有乏力、消化道癥狀、尿黃、肝大及肝功能異常等表現(xiàn)[1]。流行病學調(diào)查顯示，全球約2.4 億人為慢性乙肝患者，每年約有65萬人死于HBV相關性疾病[2]?；颊吒腥綡BV超過6個月，可導致肝臟發(fā)生不同程度炎性壞死或纖維化，嚴重者可發(fā)展成肝硬化，最終導致肝癌。目前，治療乙肝以抗病毒藥物（如恩替卡韋、富馬酸丙酚替諾福韋片、聚乙二醇干擾素α）為主，但存在免疫耐受、價格昂貴及不良反應大等問題[3-4]，因此，越來越多乙肝患者尋求中醫(yī)治療。

乙肝根據(jù)其臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)學“黃疸”“脅痛”“鼓脹”等范疇，常因濕熱疫毒之邪侵襲機體所致[5]。中醫(yī)治療乙肝注重以人為本，采取辨證論治、扶正祛邪、調(diào)整陰陽的方法，維持臟腑功能平衡，在改善臨床癥狀、抗HBV方面具有獨特優(yōu)勢。苦參主治黃疸，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《補缺肘后方》中記載苦參治療黃疸時配伍龍膽、牛膽汁等療效更顯著，《雜病源流犀燭》則明確載有龍膽苦參丸這首方劑，中成藥苦參素膠囊、肝炎靈注射液、苦黃注射液、苦膽片等，臨床常用于治療乙肝[6-9]?，F(xiàn)代藥理研究亦表明，苦參生物堿具有保肝、減輕肝臟纖維化、抑制HBV DNA的復制及乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen， HBsAg）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen， HBeAg）的分泌[10-12]。但苦參治療乙肝的具體作用機制尚缺乏系統(tǒng)認識，故本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法從整體上探討苦參治療乙肝的作用機制，為苦參的進一步研究及臨床對乙肝的防治提供指導。

1 材料與方法

1.1? 數(shù)據(jù)庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理分析平臺（traditional Chinese medi?

cine systems pharmacology datebase and analysis platform， TCMSP， https：//tcmspw.com/tcmsp.php）;中藥分子機制生物信息學分析工具（a bioinformatics analysis tool for molecular mechANism of traditional Chinese medicine， BATMAN-TCM， http：//bionet.ncpsb. org.cn/bat-man-tcm/index.php/Home/Index/index）;中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（the encyclopedia of traditional Chinese medicine， ETCM， http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）;本草組鑒數(shù)據(jù)庫（http：//herb.ac.cn/）;GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）;在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man， OMIM， https：//www.omim.org）;Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）;化源網(wǎng)（https：//www.chemsrc.com/）;韋恩在線作圖軟件（VENNY 2.1， https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）;Cytoscape軟件（Version 3.7.2）;STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）;微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/login/）;DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）;結(jié)構(gòu)生物信息學研究合作組織（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics， RCSB， www.rcsb.org）數(shù)據(jù)庫。

1.2? 乙肝相關靶點的收集

以“viral hepatitis type B”為檢索詞，在TTD、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫中進行篩選，并將GeneCards篩選條件設置為score≥20。利用Excel表格將3個數(shù)據(jù)庫所得靶點進行合并、刪除重復值。

1.3? 苦參活性成分及靶點的收集

以“苦參”為檢索詞，從TCMSP [以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、類藥性（drug-like， DL）≥0.18和小腸上皮細胞滲透率（Caco-2 permeability， Caco-2）≥0.4為篩選條件]、BATMAN-TCM（以score≥20和P<0.5為篩選條件）、ETCM和HERB數(shù)據(jù)庫中獲取活性成分及對應靶點，并通過檢索中國知網(wǎng)、萬方和Pubmed數(shù)據(jù)庫進行補充，通過VENNY作圖得到乙肝與苦參的共同靶點，將苦參活性成分中兩者非共同靶標刪除。

1.4? “活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建

將苦參活性成分和乙肝共同靶點導入Cytoscape 3.7.1進行“活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建、分析以及可視化。

1.5? 蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建

將共同靶點導入STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，把string_interactions.tsv文件導入Cytoscape進行可視化分析。

1.6? GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對共同靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，再通過微生信在線作圖工具選取P值排名靠前的結(jié)果以柱狀圖和氣泡圖形式展示。

1.7? 分子對接

首先從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載苦參成分mol2格式3D結(jié)構(gòu)，蛋白的三維結(jié)構(gòu)從RCSB數(shù)據(jù)庫下載，通過AutodockTools 1.5.6進行配體和受體準備，并保存為pdbqt文件。然后采用Autodock vina 1.1.2進行半柔性對接，將參數(shù)exhaustiveness設置為20，其他參數(shù)均采用默認值，選取affinity最佳的構(gòu)象，作為最終的對接構(gòu)象。最后選取對接打分最低的構(gòu)象用于對接結(jié)合模式分析，并通過Pymol進行作圖。

1.8? HepG2.2.15細胞體外實驗驗證

1.8.1? 細胞株、藥物、試劑及儀器? ?HepG2.2.15細胞株（廣州吉妮歐生物科技有限公司）;氧化苦參堿（索萊寶生物科技有限公司，批號IO0240）;DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司，批號8121091）;胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司，批號OW05583）;CCK-8溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司，批號7E352C9、7E482F0）;SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，批號A2A0929、A2A1444）;PCR引物（生工生物工程股份有限公司）;iMark酶標儀、My Cycler 96孔型 PCR儀、Mini-Sub Cell GT電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）;NanoDrop One超微量可見分光光度計、二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）;Light Cycler 480 Ⅱ型實時熒光定量PCR儀（上海羅氏制藥有限公司）。

1.8.2? 細胞培養(yǎng)及分組? 將HepG2.2.15細胞復蘇后，于DMEM培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清、1% 100×青鏈霉素溶液）培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察細胞形態(tài)，3 d更換1次培養(yǎng)液，當生長密度達到80%左右時，進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。分組及給藥劑量如下：正常組（氧化苦參堿濃度為0 mmol·L-1）;2 mmol·L-1組（氧化苦參堿濃度為2 mmol·L-1）;3 mmol·L-1組（氧化苦參堿濃度為3 mmol·L-1）;4 mmol·L-1組（氧化苦參堿濃度為4 mmol·L-1）;5 mmol·L-1組（氧化苦參堿濃度為5 mmol·L-1）;6 mmol·L-1組（氧化苦參堿濃度為6 mmol·L-1）。

1.8.3? CCK-8法檢測氧化苦參堿對細胞增殖的影響? 取生長狀態(tài)良好的HepG2.2.15細胞制成濃度為6×104個/mL的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各組進行加藥處理，正常組加等體積的DMEM培養(yǎng)液。藥物干預24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后取出，用酶標儀檢測450 nm的各孔吸光值。按照下列公式計算細胞存活率：

細胞存活率=[（A-C）/（B-C）]×100%

A：實驗組吸光值（為含有培養(yǎng)基、細胞、待測藥物和CCK-8溶液的吸光值）;B：對照組吸光值（為含有培養(yǎng)基、細胞、CCK-8溶液的吸光值）;C：空白組吸光值（為含有培養(yǎng)基、CCK-8溶液的吸光值）

1.8.4? qPCR檢測TNF-α、IL-6 mRNA的表達? 細胞干預24 h 后，用PBS緩沖液沖洗2遍。提取各組細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，用qPCR技術檢測細胞中TNF-α、IL-6蛋白的mRNA水平，反應程序為95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共45個循環(huán);溶解曲線95 ℃ 5 s，65 ℃ 60 s;降溫40 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法進行計算，Graphpad進行分析作圖。引物設計為TNF-α正向引物：AGCCCTGGTATGAGCCCATCTATC、TNF-α反向引物：TCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC;IL-6正向引物：CACTGGTCTTTTGGAGTTTGAG、IL-6反向引物：GGACTTTTGTACTCATCTGCAC;β-actin正向引物：CCTGGCACCCAGCACAAT、β-actin反向引物：GGGCCGGACTCGTCATAC。

2 結(jié)果

2.1? 乙肝相關靶點的收集

從TTD、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫中分別檢索到18、964和854個靶點，合并刪除重復值后共1827個。

2.2? 苦參活性成分及靶點的獲取

通過TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM和HERB數(shù)據(jù)庫檢索苦參活性成分及靶點，并查閱文獻進行補充。通過制作韋恩圖獲得苦參和乙肝共同靶點64個，將苦參活性成分中兩者非共同靶標刪除，對獲得的39個苦參活性成分（見表1）進行編號，并在化源網(wǎng)查詢相應活性成分中文名。

2.3? “活性成分-潛在靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建

將篩選獲得的39個苦參活性成分及藥物-疾病共同靶點導入Cytoscape，得到“活性成分-潛在靶點”圖（見圖1），共包含103個節(jié)點，259條邊。選取度值排名靠前的活性成分有刺芒柄花素、8-isopentenyl-kaempferol、（2R）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one、高麗槐素、氧化苦參堿、菜豆蛋白、槐果堿、苦參堿等，推測這些活性成分可能是苦參抗乙肝病毒的主要活性成分。

2.4? PPI網(wǎng)絡構(gòu)建

將篩選所得的64個共同靶點導入STRING，并將文件導入Cytoscape，構(gòu)建PPI圖（見圖2），可見IL-6、AKT1、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、TNF和MAPK1為苦參抗乙肝病毒的主要靶點。

2.5? GO功能和KEGG通路富集分析

根據(jù)P<0.01進行GO功能富集分析，選取P值排名靠前的15個結(jié)果進行展示（見圖3）。由圖可見，生物過程（biological process， BF）富集有394條，涉及對藥物的反應、對雌二醇的反應、凋亡過程的負調(diào)控、細胞對脂多糖的反應、對缺氧的反應等;分子功能（molecular function， MF）共富集到69條，涉及酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、類固醇羥化酶活性、血紅素結(jié)合等;細胞組分（cellular component， CC）富集到39條，涉及線粒體、細胞外間隙、細胞器膜、胞質(zhì)溶膠、細胞表面等。以上結(jié)果體現(xiàn)了苦參可能通過調(diào)控多個GO功能來治療乙肝。

根據(jù)P<0.01進行KEGG通路富集分析，共富集到111條通路，選取P值排名靠前的20條通路做氣泡圖（見圖4）。由圖可見苦參抗乙肝病毒通路主要富集在癌癥的通路、乙型肝炎、TNF信號通路等。這些生物過程的發(fā)生可能與乙肝關系密切。

2.6? 分子對接結(jié)果

為了從分子水平闡明蛋白與化合物的作用模式，將靶蛋白TNF、IL-6與化合物氧化苦參堿進行對接，以拉米夫定為陽性對照藥物。結(jié)果（見表2）顯示小分子化合物與靶蛋白結(jié)合能均小于-4.5 kcal·mol-1，說明均具備良好的結(jié)合活性。其中，TNF與拉米夫定、氧化苦參堿的結(jié)合能分別為-7.1、-9.8 kcal·mol-1，IL-6與拉米夫定、氧化苦參堿的結(jié)合能分別為-4.5、-6.1 kcal·mol-1，選TNF與拉米夫定、氧化苦參堿進行作圖展示。

由圖5可見蛋白TNF與拉米夫定對接得分為-7.1 kcal·mol-1，化合物和氨基酸殘基SER60形成鍵長為2.2?的氫鍵作用，和氨基酸殘基TYR151形成鍵長為2.1、3.4?的氫鍵作用，和氨基酸殘基GLY122形成鍵長為3.1?的氫鍵作用，和氨基酸殘基ILE58形成鍵長為3.4?的氫鍵作用。蛋白TNF與氧化苦參堿對接得分為-9.8 kcal·mol-1，化合物和氨基酸殘基TYR119形成鍵長為3.1?的氫鍵作用。這些相互作用使得蛋白與化合物形成穩(wěn)定的復合物，分子對接研究為化合物和蛋白的相互作用方式給予一定的解釋，為進一步研究蛋白小分子藥物奠定理論基礎。

2.7? 實驗驗證結(jié)果

2.7.1? 氧化苦參堿對細胞增殖的影響? 與A組比較，B、C、D組的細胞增殖能力沒有受到抑制，而E、F組細胞增殖受到明顯抑制（P<0.01，P<0.001）。故選取2 mmol·L-1和4 mmol·L-1這兩個藥物濃度進行后續(xù)實驗。見圖6。

2.7.2? 氧化苦參堿對TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響? 根據(jù)預測靶點的KEGG通路結(jié)果和疾病相關核心蛋白結(jié)果，選擇與TNF信號通路相關的TNF-α、IL-6蛋白進行驗證，見圖7。與正常組比較，2 mmol·L-1組IL-6 mRNA表達下調(diào)（P<0.05）;4 mmol·L-1組的TNF-α、IL-6 mRNA表達均下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

3 討論

基于“活性成分-潛在靶點”可知，刺芒柄花素、8-isopentenyl-kaempferol、（2R）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one、高麗槐素和氧化苦參堿是苦參防治乙肝的主要活性成分，再結(jié)合苦參含量測定結(jié)果可知，氧化苦參堿為最重要的活性成分[13]。PPI網(wǎng)絡顯示IL-6、AKT1、VEGFA、PTGS2、JUN、CASP3、TNF和MAPK1為苦參抗乙肝病毒的主要靶點;KEGG分析表明主要富集在癌癥的通路、乙型肝炎和TNF信號通路。TNF信號傳導通路在乙型肝炎的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用，AKT1、CASP3和MAPK1（亦稱ERK2）是下游信號傳導通路中3個重要的靶標。

TNF信號通路分為受體信號通路和下游傳導信號通路，受體信號通路包括TNFR1和TNFR2，下游信號通路包括激活核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶、半胱氨酸蛋白酶及磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路[14]。TNF-α活化后組裝成同源三聚體并與TNFR1、TNFR2受體結(jié)合，導致受體的三聚化。TNFR與配體結(jié)合后，介導TRADD或TRAF等銜接蛋白的結(jié)合，進而啟動下游信號通路的轉(zhuǎn)導，產(chǎn)生炎性因子（IL-6、TNF-α）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、炎癥介質(zhì)（PTGS2）等，導致肝臟炎癥、肝纖維化甚至發(fā)展為肝癌[15]。

TNF-α、IL-6在防治乙型肝炎中發(fā)揮了重要作用，TNF-α與細胞膜上的受體TNF-R結(jié)合，可激活NF-κB途徑，涉及炎癥反應、細胞免疫等多個環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6水平的增加與肝細胞的炎癥有關，其可能在肝損傷中發(fā)揮了重要作用，且TNF-α、IL-6水平與乙型肝炎嚴重程度相關[16]。此外，TNF-α和IL-6對HBV復制具有雙向調(diào)控作用。當機體受到TNF-α、IL-6刺激后，IκB被磷酸化，使NF-κB呈游離狀態(tài)，移入細胞核內(nèi)，促進HBV的轉(zhuǎn)錄[17]。研究表明TNF-α抗HBV的活性，可能與阻礙衣殼的形成與降低宿主對病毒的易感性有關[18-19]。而有實驗發(fā)現(xiàn)IL-6抑制HBV的復制與核衣殼減少和抑制病毒轉(zhuǎn)錄有關，且通過增強淋巴細胞功能發(fā)揮抗HBV的作用[20-21]。

基于分子對接技術顯示氧化苦參堿與IL-6、TNF-α具有良好的結(jié)合活性，初步驗證了苦參通過調(diào)控TNF信號通路發(fā)揮抗乙型肝炎的作用。本研究選取氧化苦參堿進行實驗驗證，以HepG2.2.15細胞為研究對象，結(jié)果顯示，氧化苦參堿可下調(diào)TNF-α、IL-6 mRNA的表達，且隨著劑量的增加，下調(diào)趨勢更顯著。

綜上所述，苦參具有多成分、多靶點特性，其主要成分氧化苦參堿可通過激活TNF信號通路，下調(diào)TNF-α、IL-6 mRNA的表達，控制肝臟炎癥，抑制HBV復制的作用。本研究從細胞水平初步驗證了苦參治療乙肝的基本藥理作用和相關機制，后續(xù)還需進行動物實驗，進一步明確苦參治療乙型肝炎的機制。

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