胡立明，張慶成，劉 嵐

1.南昌雙匯食品有限公司，江西 南昌 330115 2.南昌職業(yè)大學 衛(wèi)生健康學院，江西 南昌 330500 3.空軍勤務學院 航空軍需與燃料系，江蘇 徐州 221006

人體內過多的自由基會導致心血管、胃腸、內分泌、呼吸等系統(tǒng)出現(xiàn)多種疾病[1-2]，消除自由基成為研究的熱點。研究表明，補充外源性抗氧化劑對清除體內過多的自由基、維持細胞內氧化還原平衡有重要的意義[3-4]。相比于合成抗氧化劑，源于食物蛋白的抗氧化肽毒副作用低[5]，在抗氧化功能食品的研究與開發(fā)領域具有廣闊應用前景。

麥胚是小麥籽粒的生命源泉，不僅含有豐富而優(yōu)質的蛋白質、脂肪、維生素、礦物質等營養(yǎng)素，還含有谷胱甘肽、黃酮類物質、麥胚凝集素、二十八烷醇、酶等生理活性物質，被營養(yǎng)學家們譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”[6]。不同于外源蛋白酶水解，本實驗室采用內源蛋白酶法從麥胚中制備抗氧化肽，以比還原力為考察指標，對混合肽進行了分離純化，篩選活性高的部分進行結構鑒定，確定其氨基酸一級結構為纈氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸(Val-His-His-His，VHHH)，采用固相有機合成法合成了純度達98.2%的VHHH。盡管目前抗氧化肽的活性與結構之間的關系尚未完全明晰，但研究表明：肽的分子量大小、氨基酸組成和氨基酸序列都會影響其生物活性。首先，肽的生物活性與分子量大小有關，能在體內起功能活性作用的肽往往是分子質量在1 000 Da以下的小肽[7],而VHHH的分子質量小于1 000 Da。其次，氨基酸組成也會影響其抗氧化活性。VHHH中的纈氨酸和組氨酸常常出現(xiàn)在抗氧化肽中。Ko等[8]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶水解比目魚蛋白得到的肽溶液具有很強的抗氧化活性，經(jīng)過分離純化和結構鑒定，得到了氨基酸序列為Val-Cys-Ser-Val和Cys-Ala-Ala-Pr的兩條肽。Damgaard等[9]水解動物副產(chǎn)物得到不同大小(大多數(shù)低于3 kDa)和氨基酸組成的肽，所有的水解物在所使用的測定中都顯示出抗氧化能力，其中肺水解物的抗氧化能力可能主要是由于Glu和His殘基發(fā)揮了較強的鐵螯合能力，胰腺水解物的抗氧化能力可能與其高含量的Phe和Val有關。Wang等[10]認為His的咪唑環(huán)能有效增強肽的自由基清除活性。Val的作用是增加抗氧化肽在脂質或脂溶性體系中的溶解性，從而有助于提高抗氧化活性[11-12]。綜上，VHHH符合上述兩點特征。為研究VHHH抗氧化能力，作者對其3種體外抗氧化能力和在細胞中的抗氧化活性進行了研究，為其開展體內試驗以及開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固相有機合成抗氧化肽VHHH：純度為98.2%。人外周血：健康成年志愿者提供。

亞油酸、DPPH、還原型谷胱甘肽(GSH)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、葡聚糖(Dextran)：均為分析純，美國Sigma公司；核黃素(VB2)、L-蛋氨酸(Met)、氮藍四唑(NBT)、六氫吡啶、鄰苯二酚、CuSO4：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；H2O2：分析純，廣州科霸化工有限公司；清除羥自由基能力測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒：南京建成生物有限公司；Tb 4101 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒：上海通善生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶：美國Gibco公司；CCK 8試劑盒：日本同仁化學研究所。

1.2 儀器與設備

FACS101流式細胞儀：美國BD公司；9602G酶標儀：北京普朗醫(yī)療器械公司；UV-2802紫外可見分光光度計：尤尼柯(上海)儀器有限公司；DP70顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 中性粒細胞分離

參照文獻[13]并適當調整。取外周靜脈血5 mL，加入 6%葡聚糖混勻，室溫放置 30 min；上層為白細胞混合層，下層為紅細胞層。取一新管加入淋巴細胞分離液，緩慢加入富含白細胞的上層混合液(與淋巴細胞分離液的體積比為1∶ 1)，1 500 r/min 離心 20 min，取中間層；加入冰冷雙重水，迅速裂解其中的少量紅細胞，按質量比3∶ 1加入KCl溶液并混勻，1 300 r/min 離心 6 min，離心后去上清液，底層即為中性粒細胞，加入 1 mL pH 7.0 PBS液制成細胞懸液。

1.3.2 VHHH抗氧化細胞試驗

取6孔板，分3組進行試驗[13]：各組加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中性粒細胞(細胞密度為1×105個/mL)12 h，換1 mL新鮮含血清的培養(yǎng)基。第1組加入2 μL H2O2；第2組在加入2 μL H2O2的同時分別加入合成肽VHHH 250、500、1 000、2 000 μg；第3組設為對照，不添加任何試劑。所有細胞加試劑培養(yǎng)2 h后測凋亡率。按同樣處理方法在96孔板分組培養(yǎng)細胞，2 h后測細胞增殖率和細胞SOD活性。

1.3.3 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除力測定參照張雪嬌等[14]的方法，計算清除率。

式中：A對為對照管吸光度；A樣為樣品管吸光度；A標為標準管吸光度；A0為空白管吸光度。

1.3.4 超氧陰離子清除能力的測定

超氧陰離子清除能力采用NBT光化還原法，操作步驟參照Girgih等[15]的方法，并適當調整。測定時依次加入2.5 mL 50 mmol/L pH 7.8 PBS緩沖液、2 mL 195 mmol/L Met、0.1 mL 3 μmol/L EDTA、0.1 mL不同濃度的還原劑、0.2 mL 1.125 mmol/L NBT和0.1 mL 60 μmol/L核黃素溶液，混合均勻，于25 ℃ 4 000 Lux光照10 min，立即避光，在560 nm下迅速測定吸光度。以無光照的混合液吸光度為對照(記為A0)，不加還原劑的反應管作為最大光化還原管(記為Aj)，樣品溶液的吸光度記為A1。超氧陰離子清除能力以抑制率表示。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

參照Lu等[16]的方法并稍加調整。分別取2 mL 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的VHHH溶液與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合加入具塞試管中，迅速振搖并在室溫下避光靜置60 min，以無水乙醇作為參比，在517 nm處比色，測定吸光度(A1)，同時測定2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合液的吸光度(A2)，2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇的吸光度(A0)，計算自由基抑制率。

1.3.6 銅離子螯合力的測定

參考文獻[17]的方法并適當調整。取1 mL 2 mmol/L CuSO4、1 mL六氫吡啶(pH 7.0)和20 μL 0.1%鄰苯二酚充分混合，然后加入1 mL不同濃度的樣品溶液后，混勻，反應5 min，在632 nm波長下測定吸光度。以水代替樣品溶液作為空白樣，計算Cu2+螯合力。

式中：A0為空白樣品吸光度；AS為樣品吸光度。

1.3.7 凋亡率的測定

參考文獻[18]的方法并稍加修改。將孔內培養(yǎng)液棄除，加入0.3%胰酶消化6 min，收集消化液，1 500 r/min離心5 min，去除上清液。分別向每管中加入100 μL凋亡測試緩沖液、5 μL PI和5 μL Annexin-V，室溫酶解10 min，上流式細胞儀檢測凋亡率，流速100個/s。

1.3.8 細胞增殖率的測定

參考文獻[18]，取1.3.2在96孔板內培養(yǎng)的細胞，向各孔分別加入10 μL KIT-8，2 h后在酶標儀上檢測450 nm處的吸光度。

1.3.9 SOD活性的測定

參照試劑盒說明書，去除各孔內的培養(yǎng)液，并用0.1 mmol/L pH 7.2 PBS緩沖液清洗3遍，加入細胞裂解液，在冰上裂解30 min，收集裂解后的細胞液，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液60 μL，每孔分別加入20 μL SOD活性檢測試劑以及底物工作液，37 ℃孵育30 min，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗均做3次重復，結果以平均值±標準差表示，用SPSS 12.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 羥基自由基清除能力

羥基自由基是最活潑的一類自由基，能夠與蛋白質、核酸、脂質等發(fā)生反應，使以上物質過氧化和DNA突變，從而導致細胞氧化損傷[19]。由圖1可知，隨著質量濃度的增加，清除能力也相應增加，但增幅趨緩。從同一質量濃度下的清除效果看，VHHH清除效果高于GSH。在質量濃度為0.20 mg/mL時，VHHH清除率為57.84%±0.14%，而GSH僅為17.96%±0.91%。

圖1 VHHH和GSH的羥基自由基清除能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging of VHHH and GSH

2.2 超氧陰離子清除能力

圖2 VHHH和GSH的超氧陰離子清除能力Fig.2 Superoxide radical scavenging of VHHH and GSH

超氧陰離子自由基能夠生成羥基自由基等活潑的自由基[20]。由圖2可知，隨著質量濃度增加，VHHH和GSH的清除率均增強，VHHH在質量濃度高于0.20 mg/mL后清除率增幅趨緩。從相同質量濃度的清除效果來看，在質量濃度低于0.80 mg/mL時，VHHH清除率高于GSH，表明VHHH在低濃度時有較強的超氧陰離子清除能力。

2.3 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定的以氮為中心的合成自由基，常常用于物質抗氧化能力的體外測定。由圖3可知，隨著質量濃度增加，二者的清除率都提高。當質量濃度大于0.60 mg/mL時，二者清除率變化不大。當質量濃度為0.80 mg/mL和1.00 mg/mL時，GSH清除率分別為64.14%±1.95%、64.35%±0.51%。在同一質量濃度時，GSH清除率明顯高于VHHH清除率。

圖3 VHHH和GSH的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging of VHHH and GSH

2.4 銅離子螯合力

銅離子、鐵離子等金屬離子是非常強的自由基發(fā)生劑，在油脂的自氧化過程中，微量的金屬離子可使油脂氧化的誘導速率提高1036倍，金屬離子的存在使得捕捉自由基的抗氧化劑很快被消耗[21]。因此對金屬離子的螯合有利于抗氧化作用。由圖4可知，VHHH和GSH的螯合力都隨著質量濃度增加而增加，在質量濃度小于0.60 mg/mL時，螯合力相差較大，當質量濃度大于0.60 mg/mL時，差距逐漸縮小。

圖4 VHHH和GSH的銅離子螯合能力Fig.4 Copper chelateing ability of VHHH and GSH

2.5 VHHH和GSH的IC50的比較

由表1可知，在清除生物體內自由基方面，VHHH的清除能力強于GSH(清除羥基自由基IC50分別為0.39 mg/mL和0.64 mg/mL，清除超氧陰離子IC50分別為0.73 mg/mL和0.81 mg/mL)，而在清除人工合成的DPPH自由基方面，VHHH清除能力低于GSH(分別為1.78 mg/mL和0.57 mg/mL)。從銅離子螯合能力來看，VHHH低于GSH(分別為0.64 mg/mL和0.37 mg/mL)。

表1 VHHH和GSH的抗氧化能力比較Table 1 Comparison of antioxidant activity of VHHH and GSH

2.6 VHHH對細胞抗氧化的影響

注：Q1區(qū)域為壞死細胞；Q2區(qū)域為晚期凋亡細胞；Q3區(qū)域為早期凋亡細胞；Q4區(qū)域為活細胞；細胞凋亡率為Q2和Q3象限百分率之和。圖5 VHHH對氧化脅迫下中性粒細胞凋亡率的影響Fig.5 Effect of VHHH on the survival rate of polymorphonuclear neutrophil under oxidative stress

圖6 VHHH對氧化脅迫下中性粒細胞增殖率的影響Fig.6 Effect of VHHH on the proliferation rate of polymorphonuclear neutrophil under oxidative stress

圖7 VHHH對氧化脅迫下SOD活性的影響Fig.7 Effect of VHHH on SOD activity of polymorphonuclear neutrophil under oxidative stress

圖8 KIT-8吸光度與SOD活性之間的關系Fig.8 Relationship between absorbance of KIT-8 and SOD activity

3 討論與小結

H2O2是一種常見的氧自由基產(chǎn)生物，在機體中容易分解產(chǎn)生羥自由基或氧自由基導致細胞過氧化損傷。當機體受到氧化應激時，抗氧化劑可以延緩細胞損傷程度。有學者從海參、安康魚肌肉中提取的多肽被發(fā)現(xiàn)能有效清除自由基和超氧陰離子，對 H2O2誘導損傷的 RAW 264.7 細胞具有顯著的保護作用[23-24]。本研究表明VHHH可通過提高SOD活性抗H2O2致細胞氧化作用。Himaya等[25]發(fā)現(xiàn)一種來自魚皮的抗氧化六肽GGFDMG和十肽LLMLDNDLPP具有清除細胞內活性氧活性的同時，能夠上調抗氧化酶SOD的表達水平，幫助細胞抵抗H2O2誘導的氧化應激，結果與本研究類似。郭勇等[26]發(fā)現(xiàn)長白山核桃源五肽Leu-Pro-Leu-Leu-Arg(LPLLR)能通過提高SOD酶的活性等方式對H2O2誘導氧化損傷的PC12細胞起一定保護作用。在機體中SOD存在3種形式：SOD1存在于細胞質中，SOD2存在于線粒體中，SOD3存在于細胞外[27]。但VHHH如何誘導SOD蛋白表達還需要深入研究。

VHHH具有較強的體外和細胞內抗氧化活性。由于體外抗氧化測定方法及細胞試驗無法考慮在體內的吸收、代謝和藥效等因素，導致體外和體內抗氧化活性之間存在差異，因此還需通過體內試驗研究VHHH抗氧化能力，為其開發(fā)和應用奠定理論基礎。