渠麗麗 張英博 董海影 劉得水 陳培培 張曉杰

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是常見的神經(jīng)退行性疾病，其特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退化，紋狀體多巴胺顯著減少[1]。PD 最明顯的癥狀表現(xiàn)為震顫、僵硬、動作遲緩、姿勢不穩(wěn)和行走困難[2]。研究顯示，活性氧的過度產(chǎn)生、氧化應(yīng)激[3]和線粒體功能障礙[4-5]是PD 發(fā)病的原因。因此，尋找可以緩解PD 癥狀及預(yù)防多巴胺能神經(jīng)元變性的新藥對于PD 的治療很重要。近年來，中藥及其中藥單體成分對PD 的治療或輔助治療越來越受到人們的關(guān)注[6]。牛膝是一種傳統(tǒng)的中草藥，其水煎液具有抗氧化藥理活性[7-8]。β-蛻皮甾酮是牛膝等幾種中草藥的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，β-蛻皮甾酮可清除自由基發(fā)揮抗氧化效應(yīng)[9-10]，具有抑制腦組織脂質(zhì)過氧化損傷的作用[11-12]。而激活PI3K/AKT 通路具有一定的抗氧化作用[13]。本研究擬采用MPTP 構(gòu)建小鼠PD 模型，探討β-蛻皮甾酮通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 通路保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元并減弱細(xì)胞凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 材料

購買42 只C57BL/6 雄性小鼠，月齡8 周，體重為（20±2）g[遼寧長生生物，許可證號：SCXK（遼）2020-0001]。MPTP（美國SIGMA）；β-蛻皮甾酮（MCE）；司來吉蘭（芬蘭orion corporation）；PI3K（Affinit，批號：AF6241）；TH、P-PI3（CST，批號：58844S；4228T）；AKT、P-PAKT、BAX 及BCL-2（武漢三鷹，批號：60203、66444、50599、12789）；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、二抗（博士德，AR1192、AR1183、BA1054、BA1050）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)；批號：P0012S）；eECL 顯影液（康為世紀(jì)，批號：CW0049S）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國ABI）；實時熒光定量PCR 儀（美國ABI）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 按隨機區(qū)組法對小鼠稱重進(jìn)行分組，后用隨機數(shù)字表法將42 只小鼠分為正常組（A 組）、模型組（B 組）、司來吉蘭組（10 mg/kg）（C 組）、β-蛻皮甾酮高（30 mg/kg）（D 組）、中（10 mg/kg）（E 組）、低（3 mg/kg）（F 組）劑量組，每組7 只，各治療組于造模前分別用相應(yīng)劑量藥物進(jìn)行灌胃，持續(xù)14 d，正常組與模型組分別用等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 模型制備 給予治療藥第10 天起，小鼠腹腔注射MPTP（30 mg/kg）[14]，連續(xù)注射5 d。造模后可見小鼠出現(xiàn)震顫、豎毛、弓背、后腳伸直、流涎等表現(xiàn)。

1.2.3 組織取材 小鼠處死，冰上快速取腦。

1.2.4 行為學(xué)觀察 將小鼠固定在桿頂部，記錄其從頭到尾下落時間，每只小鼠測3 次，取平均值。將小鼠前爪放在電線中間，后肢懸空。評分標(biāo)準(zhǔn)：雙后肢抓住繩索為0 分，一只后肢抓住繩索為1 分，雙后肢均抓不住繩索為2 分。檢測時間1 min，連測3 d 取平均值。

1.2.5 Western blot 取小鼠黑質(zhì)，加裂解液冰上勻漿，渦旋混勻，離心（13 500 r/min，離心半徑7.5 cm）吸上清。BCA 法測定蛋白濃度，于沸水中變性。取蛋白樣品用10%SDS-PAGE 凝膠分離，轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，TBST 漂洗后顯影。

1.2.6 RT-qPCR Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置RT-qPCR 體系：SYBR Green 預(yù)混液10.4 μl，cDNA 2 μl，正反向引物各0.8 μl，滅菌水補足20 μl 體系。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s，40 個循環(huán)（95℃5 s，60℃31 s，95℃15 s）。置于熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴增。比較CT 法用于計算經(jīng)GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)變化。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0、Origin 2021 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗或方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)檢測比較

B 組小鼠爬桿時間長于A 組，C、D、E 組小鼠爬桿時間短于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；F 組爬桿時間與B 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B 組小鼠懸掛評分高于A 組，C、D、E 組小鼠懸掛評分低于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；F 組懸掛評分與B 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組行為學(xué)檢測比較（n=7）

2.2 β-蛻皮甾酮對蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 TH 蛋白表達(dá)B 組TH 表達(dá)低于A 組，C、D、E 組TH 表達(dá)高于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；F 組TH 表達(dá)與B 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 Western blot 檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)TH 蛋白含量（n=7）

2.2.2 β-蛻皮甾酮通過PI3K/AKT 通路減弱MPTP致PD 小鼠的細(xì)胞凋亡B 組P-PI3K/PI3K 及P-PAkt/Akt比值低于A 組，C、D、E 組P-PI3K/PI3K 及P-PAkt/Akt比值高于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；F 組P-PI3K/PI3K 及P-PAkt/Akt 比值與B 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。B 組抑凋亡蛋白BCL-2表達(dá)低于A 組，促凋亡蛋白BAX 表達(dá)高于A 組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；C、D、E 組BCL-2蛋白表達(dá)高于B 組，BAX 蛋白表達(dá)低于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；F 組BCL-2、BAX 蛋白表達(dá)與B 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3～4。

圖3 Western blot 檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)P-PI3K、PI3K、P-Akt、Akt 蛋白含量（n=7）

2.3 BCL-2、BAX mRNA 的表達(dá)

B 組BCL-2 mRNA 表達(dá)量低于A 組，C、D、E 組BCL-2 mRNA 表達(dá)量高于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。B 組BAX mRNA 表達(dá)量高于A 組，C、D、E組BAX mRNA 表達(dá)量低于B 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；F 組BCL-2 及BAX mRNA 表達(dá)量與B 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖4 Western Blot 檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)BCL-2、BAX 蛋白含量（n=7）

圖5 PCR 檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)BCL-2、AX mRNA 含量（n=7）

3 討論

PD 是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，具有運動遲緩、靜息性震顫和強直等癥狀[15]。PD 發(fā)病與環(huán)境、衰老和遺傳因素有關(guān)，氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂是散發(fā)型和家族型PD 多巴胺能神經(jīng)元死亡的發(fā)病機制[16]。目前，PD 的主要藥物治療是通過左旋多巴補充多巴胺[17]。而多巴胺補充劑只能緩解疾病癥狀，不能減緩PD 進(jìn)展，長期使用左旋多巴會導(dǎo)致致殘波動和運動障礙[18]。

體外實驗證實β-蛻皮甾酮對MPP+誘導(dǎo)的PD模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[19]，但體內(nèi)經(jīng)PI3K/Akt 通路是否有助于緩解PD 尚未闡明。此研究中，MPTP 體內(nèi)誘導(dǎo)PD 小鼠模型，擬找出β-蛻皮甾酮對PD 治療的影響。司來吉蘭用作陽性對照藥物評估β-蛻皮甾酮的相對治療效果[20]。行為學(xué)實驗中爬桿和懸掛實驗是測量PD 小鼠運動遲緩、評估肌肉力量的有效方法，結(jié)果顯示，β-蛻皮甾酮以劑量依賴式緩解PD 小鼠的運動遲緩和肌強直等癥狀。TH 一種合成多巴胺的限速酶，且研究表明TH 在PD 發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[21]。研究采用Western blot 檢測TH 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，β-蛻皮甾酮以劑量依賴式上調(diào)TH 蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt 通路可減弱MPTP 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]，且經(jīng)證實其可調(diào)節(jié)下游Nrf-2 信號[23]。Nrf-2 抗氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，活化入核后可誘導(dǎo)下游超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等Ⅱ相抗氧化解毒酶轉(zhuǎn)錄[24]，繼而對抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元壞死。促凋亡蛋白Bax 和抑凋亡蛋白Bcl-2 之間的平衡在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著重要作用[25]，研究顯示，MPTP 可擾亂了Bax 和Bcl-2 之間的平衡[26]。本研究顯示，中、高劑量β-蛻皮甾酮治療減弱MPTP 引起的PI3K 和Akt 磷酸化的下調(diào)，并顯著抑制促凋亡蛋白，增強抑凋亡蛋白表達(dá)。RT-qPCR 結(jié)果中各組小鼠Bcl-2與BAX mRNA 表達(dá)量進(jìn)一步證實β-蛻皮甾酮以劑量依賴式改善由MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，β-蛻皮甾酮以劑量依賴式激活PI3K/Akt 通路改善MPTP 致PD 小鼠的神經(jīng)元損傷并減弱細(xì)胞凋亡，繼而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。