林建平 王 浩 劉海潮 李 明 王詩忠 陳少清

1.福建醫(yī)科大學(xué)健康學(xué)院，福建福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；

骨骼肌損傷超過60%屬于鈍挫傷[1-2]。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能在肌肉疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[3-6]。研究證實，炎癥刺激能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號通路[7-8]。UPR 在肌肉干細胞穩(wěn)態(tài)、肌原性分化和損傷骨骼肌再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。推拿對骨骼肌損傷療效獨特，但作用機制不明確[9]。本研究通過觀察推拿對骨骼肌鈍挫傷模型大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein of 78 kDa，GRP78）及炎癥：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，探討推拿治療骨骼肌鈍挫傷的起效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級6 周齡健康雄性SD 大鼠24 只，體重（220±20）g，由福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號碼：SCXK（閩）2016-0002，實驗動物合格證號：20170012003202。通過福建醫(yī)科大學(xué)動物倫理審查委員會審批（FJMUIACUC2020-0038）。動物飼養(yǎng)模擬標準日夜系統(tǒng)，室內(nèi)恒溫20℃，相對濕度控制在50%，自由食物和飲水。

1.2 主要試劑與儀器

HE 染色套裝（Servicebio 公司，貨號：G1003）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Thermo fisher 公司，貨號：MAN0017 380）；GRP78 抗體（Proteintech 公司，貨號：66574-1-Ig）；CRT 抗體（Proteintech 公司，貨號：10292-1-AP）；GoatAnti-MouseIgG（Proteintech公司，貨號：SA00001-1）；GoatAnti-RabbitIgG（Proteintech公司，貨號：SA00001-2）；自制大鼠固定器（ZL202120268993.6，發(fā)明人：林建平），自制推拿按摩指套（ZL201821318407.9，發(fā)明人：林志剛）。

1.3 動物分組

大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，采用隨機數(shù)字表法將24 只大鼠分為四組：空白組、模型組、推拿穴位組、推拿非穴位組，每組6 只?？瞻捉M僅常規(guī)喂養(yǎng)，其余建立大鼠腓腸肌鈍挫傷模型。

1.4 制作大鼠腓腸肌鈍挫傷模型

通過特定裝置撞擊大鼠右后肢腓腸肌，制作大鼠腓腸肌鈍挫傷模型[10-11]。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠后，將170 g 重物通過導(dǎo)管從0.7 m 的高度落下，精準打擊到大鼠肌肉腹部，每次打擊動能約為1.166 2 J，實驗過程共打擊5 次，總的打擊能量為5.831 J。

造模成功標準：肉眼可見大鼠皮膚出現(xiàn)瘀斑，損傷部位明顯紅腫，HE 染色觀察到大鼠打擊部位肌纖維排列散亂、出現(xiàn)斷裂、溶解和瘢痕組織[11-12]。

1.5 推拿干預(yù)

造模1 d 后開始推拿干預(yù)，采用自制推拿按摩指套點按右側(cè)陰陵泉，刺激力量為4 N，每次點按30 s，間隔10 s，共點按20 次，連續(xù)7 d。推拿非穴位組：取陰陵泉同一水平線與膽經(jīng)和膀胱經(jīng)的中線相交點，其他操作同推拿穴位組。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 HE 染色觀察大鼠肌肉組織形態(tài) 將各組腓腸肌標本從4%多聚甲醛中取出，依次梯度酒精脫水后包埋成蠟塊，切片、烤片后用HE 染色，后無水乙醇、二甲苯中脫色透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 ELISA 測定骨骼肌TNF-α 及其SERCA 含量取出標本，加入一定比例裂解液，在4℃、離心半徑13 cm、14 000 r/min 離心10 min后，取上清液進行ELISA 測定，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書步驟進行實驗操作。

1.6.3 Western blot 測定CRT、GRP78 表達 取出標本，加入一定比例裂解液，4℃、離心半徑8 cm、14 000 r/min 離心20 min 后，取出上清液，檢測蛋白濃度，變形，上樣，SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗（GRP78 濃度為1∶5 000，CRT 濃度1∶5 000）和二抗分別為Goat Anti-Mouse IgG 和Goat Anti-Rabbit IgG，稀釋濃度均為1∶5 000，洗膜后加入顯影液進行顯影處理，最后使用Image-lab 軟件進行灰度值的測量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用單因素方差分析，當滿足方差齊性檢驗時采用LSD-t 法進行不同組間兩兩比較，方差不齊時采用Tamhane’s T2 分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)比較

空白組肌纖維橫切面排列致密，沒有出現(xiàn)斷裂或瘢痕組織，結(jié)構(gòu)完整清晰（圖1A）。模型組肌纖維明顯散亂、斷裂，部分肌纖維出現(xiàn)溶解，瘢痕組織面積較大（圖1B）。推拿穴位組肌纖維排列較整齊，斷裂、溶解、瘢痕組織明顯減少（圖1C）。推拿非穴組仍殘留較多的瘢痕組織，肌纖維排列較為疏松（圖1D）。

圖1 各組大鼠腓腸肌組織形態(tài)學(xué)比較（黑色箭頭表示肌纖維明顯斷裂，部分肌纖維出現(xiàn)溶解，HE 染色，100×）

2.2 各組大鼠腓腸肌組織中TNF-α 含量比較

與空白組比較，模型組大鼠腓腸肌中TNF-α 含量升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，推拿穴位組、推拿非穴組大鼠腓腸肌中TNF-α含量均降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與推拿非穴位組比較，推拿穴位組中TNF-α 含量低于推拿非穴位組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腓腸肌組織中TNF-α 含量比較（pg/ml，）

表1 各組大鼠腓腸肌組織中TNF-α 含量比較（pg/ml，）

注 與空白組比較，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與推拿非穴位組比較，cP＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α

2.3 各組大鼠腓腸肌組織中SERCA 含量比較

與空白組比較，模型組大鼠腓腸肌中SERCA 含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，推拿穴位組、推拿非穴組大鼠腓腸肌SERCA 含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；推拿穴組中SERCA含量與推拿非穴位組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腓腸肌組織中SERCA 含量比較（pg/ml）

表2 各組大鼠腓腸肌組織中SERCA 含量比較（pg/ml）

注 與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。SERCA：Ca2+-ATP 酶

2.4 各組大鼠腓腸肌GRP78、CRT 表達比較

與空白組比較，模型組大鼠腓腸肌中GRP78、CRT 蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，推拿穴位組、推拿非穴組大鼠腓腸肌中GRP78、CRT 蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；與推拿非穴位組比較，推拿穴組中GRP78、CRT 蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 大鼠腓腸肌GRP78、CRT 蛋白條帶圖

表3 各組大鼠腓腸肌組織中GRP78、CRT 蛋白表達比較（積分光密度值，）

表3 各組大鼠腓腸肌組織中GRP78、CRT 蛋白表達比較（積分光密度值，）

注 與空白組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與推拿非穴位組比較，cP＜0.05。GRP78：葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；CRT：鈣網(wǎng)蛋白

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+貯存和蛋白質(zhì)加工主要場所，骨骼肌損傷后引起SERCA 功能受損，使Ca2+回收受阻，Ca2+失調(diào)通過促進線粒體的活性氧等物質(zhì)的產(chǎn)生，從而擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的蛋白質(zhì)正常折疊，促使異常蛋白質(zhì)生成增多[13]，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激加重細胞炎癥、自噬、凋亡反應(yīng)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)推拿可有效改善骨骼肌鈍挫傷大鼠肌肉的病理形態(tài)，上調(diào)SERCA 表達，并抑制炎癥因子TNF-α 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白（CRT、GRP78）的表達。

在胰島β 細胞、肝細胞和巨噬細胞等多種細胞中，均發(fā)現(xiàn)促炎性細胞因子TNF-α 的釋放，引發(fā)或加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7]。促炎性細胞因子能直接下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上SERCA 表達使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+水平降低，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8,16]。此外，過度炎癥時，高濃度的細胞溶解物和毒素會損傷肌肉組織，使修復(fù)效率大大降低[17]。研究表明，推拿具有很好的抗炎作用[18-19]。本研究亦顯示推拿可改善骼肌鈍挫傷模型大鼠的TNF-α 表達，上調(diào)SERCA 表達。提示推拿有效抑制炎癥，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵功能，從而影響肌肉損傷的修復(fù)。

GRP78、CRT 是存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+依賴分子伴侶，廣泛參與了蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運功能[20]。未折疊或錯誤折疊蛋白增加時，GRP78 通過解離并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的3 個跨膜信號蛋白：f 肌醇酶1，蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和轉(zhuǎn)錄激活因子6[21]，從而啟動UPR 反應(yīng)[22-23]。骨骼肌損傷可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常折疊蛋白的聚集和滯留而上調(diào)GRP78、CRT 表達[24-25]。結(jié)果顯示，推拿可下調(diào)CRT、GRP78 表達，且推拿穴位組低于推拿非穴組，提示推拿可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且推拿穴位優(yōu)于推拿非穴位。

綜上所述，推拿有效改善骨骼肌鈍挫傷大鼠的肌肉病理形態(tài)，其作用機制可能與上調(diào)SERCA，抑制TNF-α、CRT、GRP78 表達相關(guān)。