楊德勇 凱沙爾·百合提亞爾 姜鈞耀 舒 莉▲

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外一科，新疆烏魯木齊 830002；2.河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 471003

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）損傷發(fā)病率高[1-2]，目前ACL 重建失敗率為0.7%～10.0%[3-4]，其中腱骨愈合不良是重要原因之一[5-6]。為了加速腱骨愈合，干細(xì)胞移植和生長因子植入是目前的研究熱點(diǎn)[7-8]，然而單獨(dú)使用干細(xì)胞或生長因子都有較大的局限性[9-10]。本研究將攜帶高表達(dá)肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因的腺病毒轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）中，使HGF 在MSCs 擴(kuò)增及分化的過程中持續(xù)表達(dá)，以期促進(jìn)ACL 腱骨愈合。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭兔45 只（雄性），3～5 個(gè)月，體重3.0～3.5 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證SCXK（新）2018-0002，使用許可證SYXK（新）2018-0003，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)批準(zhǔn)（XJYK20211125）。實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境中，溫度（22±2）℃，濕度60%～80%。

1.2 主要試劑及設(shè)備

兔MSCs（武漢普諾賽生物科技有限公司，CPRb007）；凍干纖維蛋白膠（華蘭生物工程股份有限公司，S20020084）；攜帶重組HGF 基因的腺病毒載體（Ad-HGF）（上海漢恒生物科技有限公司，KS11672）；Trizol試劑（美國Invitrogen，15596026）；ReverttAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo，K1621）NanoDrop 2000 紫外-可見分光光度計(jì)（美國Thermo）；熒光顯微鏡（日本Olympus，V251947）；數(shù)字化電子萬能生物材料試驗(yàn)機(jī)（深圳德邁勝公司，DMS-2T）。

1.3 研究方法

1.3.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將兔分為A、B、C組，每組15 只，行雙后肢ACL 重建。A 組術(shù)后不注射任何物質(zhì)；B 組術(shù)后脛骨骨道內(nèi)注射MSCs 纖維蛋白膠；C 組術(shù)后脛骨骨道內(nèi)注射HGF 修飾的MSCs 纖維蛋白膠。

1.3.2 HGF 轉(zhuǎn)染MSCs 將兔MSCs（2×105/孔）接種于6 孔板內(nèi)（培養(yǎng)體系含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基），待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染。37℃下，以感染復(fù)數(shù)MOI=150 加入2 ml 含Ad-GFPHGF 的α-MEM 培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h后，更換培養(yǎng)基。48 h 后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率；術(shù)前4 h 配置纖維蛋白膠。

1.3.3 ACL 重建A 組兔麻醉后，取跟腱為移植腱，長4 cm，直徑2 mm[11]。顯露膝關(guān)節(jié)，切斷ACL，使用直徑2 mm 克氏針鉆取股骨、脛骨隧道。移植腱經(jīng)脛、股骨隧道穿過，股骨外側(cè)皮質(zhì)鉆孔，將韌帶經(jīng)骨孔縫合在股骨隧道外口皮質(zhì)處；屈膝30°，收緊脛骨隧道內(nèi)移植腱，同法固定脛骨止點(diǎn)，屈伸膝關(guān)節(jié)，ACL 牢靠，造模成功[12-13]，逐層縫合（圖1A）。B 組ACL 重建后取0.2 ml MSCs 懸液，細(xì)胞濃度5×109/L，與2 ml 纖維蛋白膠混合，注射至脛骨骨道內(nèi)。C 組ACL 重建后取0.2 ml HGF 基因轉(zhuǎn)染MSCs 懸液，細(xì)胞濃度為5×109/L，與2 ml 纖維蛋白膠混合，注射至脛骨骨道內(nèi)。

1.3.4 腱骨組織學(xué)觀察和關(guān)節(jié)液抽取 術(shù)后6 周處死實(shí)驗(yàn)兔（圖1B），1 ml 注射器（含1 ml 注射用水）刺入關(guān)節(jié)腔，反復(fù)抽注，吸取關(guān)節(jié)液。取左側(cè)腱骨組織行HE 染色。

1.3.5 力學(xué)檢測 右膝保留脛、股骨各4 cm 結(jié)構(gòu)，為防止移植腱在實(shí)驗(yàn)時(shí)從股骨骨道內(nèi)脫出，先使用牙托粉填塞股骨骨道，隨后包埋兩端骨質(zhì)，剔除多余組織，獲得股骨-移植腱-脛骨標(biāo)本，進(jìn)行拉力實(shí)驗(yàn)（圖1C）。

圖1 兔ACL 重建及力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.6 RT-PCR 檢測 拉力實(shí)驗(yàn)后取脛骨骨道內(nèi)骨組織3 mm3，RT-PCR 檢測成纖維細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）、SMAD4 mRNA 及關(guān)節(jié)液HGF mRNA 的表達(dá)。PCR 反應(yīng)體系：2×SYBR Green Select Mix 5 μl，正向引物0.7 μl，反向引物0.7 μl，ROX 0.05 μl，cDNA 1 μl，RNase-free Water 10 μl。反應(yīng)條件：94℃×5 min，56℃×40 s，72℃×30 s，40 個(gè)循環(huán)，結(jié)束后，取反應(yīng)液5 μl 進(jìn)行電泳，確認(rèn)產(chǎn)物。β-actin為對(duì)照，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物列表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后6 周，A 組腱骨分界連接疏松，膠原纖維排列紊亂（圖2D）；B 組腱骨界面連接較緊密，間隙小，但膠原纖維排列仍不整齊（圖2E）；C 組腱骨界面連接緊密，無明顯間隙，膠原纖維排列較整齊（圖2F）。

圖2 腱骨愈合組織學(xué)（HE 染色，100×）

2.2 各組術(shù)后6 周各組拉力測試結(jié)果比較

術(shù)后6 周，B 組最大拉力載荷高于A 組，且C 組高于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、B 組及B、C 組最大拉伸距離比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組術(shù)后6 周各組拉力測試結(jié)果比較（）

表2 各組術(shù)后6 周各組拉力測試結(jié)果比較（）

注 與A 組比較，aP＜0.05；與B 組比較，bP＜0.05

2.3 各組骨道內(nèi)FGF2 mRNA、SMAD4 mRNA 及關(guān)節(jié)液HGF mRNA 比較

B 組骨道內(nèi)FGF2 mRNA、SMAD4 mRNA 大于A組，且C 組大于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C 組關(guān)節(jié)液HGF mRNA 大于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 各組骨道內(nèi)FGF2、SMAD4 mRNA 及關(guān)節(jié)液HGF mRNA比較（）

表3 各組骨道內(nèi)FGF2、SMAD4 mRNA 及關(guān)節(jié)液HGF mRNA比較（）

注 與A 組比較，aP＜0.05；與B 組比較，bP＜0.05。FGF2：成纖維細(xì)胞生長因子2；HGF：肝細(xì)胞生長因子

圖3 mRNA 電泳圖

3 討論

ACL 術(shù)后腱骨愈合需多種細(xì)胞及因子的參與[14]。HGF 具有促進(jìn)血管增生，減少細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞增殖等作用[15-16]。研究顯示，HGF 能夠促進(jìn)腱骨愈合[17]，然而單純應(yīng)用HGF 降解速度快，難以持續(xù)發(fā)揮作用，本研究將HGF 轉(zhuǎn)入MSCs 中，達(dá)到了長期發(fā)揮作用的目的。

組織學(xué)觀察、力學(xué)實(shí)驗(yàn)是測試腱骨愈合的傳統(tǒng)方法[18]。本研究結(jié)果顯示，C 組腱骨連接緊密，膠原纖維排列規(guī)整，最大拉力載荷高于B 組，提示局部應(yīng)用HGF 轉(zhuǎn)染MSCs 能夠促進(jìn)ACL 腱骨愈合。

FGF2 具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、分化，增加Ⅰ、Ⅲ型膠原等功能[19]。局部使用FGF2 能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞、腱原母細(xì)胞增生，加速腱骨愈合[20-22]。SMAD4 以三聚體的形式在BMP、TGF-β 信號(hào)通路中發(fā)揮骨代謝作用[23]，增加SMAD4 的表達(dá)，可以促進(jìn)骨形成，反之則造成骨流失[24-25]。本研究結(jié)果顯示，C 組FGF2 mRNA、SMAD4 mRNA 大于B 組，提示局部注射HGF 轉(zhuǎn)染MSCs 可能通過提高細(xì)胞因子及激活BMP、TGF-β信號(hào)通路來促進(jìn)腱骨愈合。

綜上所述，局部注射HGF 轉(zhuǎn)染MSCs 能夠促進(jìn)腱骨愈合，其機(jī)制可能是通過提高細(xì)胞因子及激活經(jīng)典骨代謝信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。