韓路拓，關(guān) 瑜，任鈞國，劉建勛，郭宏偉，楊佳妹，王 攀

糖尿病病人心血管并發(fā)癥之一為糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)，DCM是危險且常見的并發(fā)癥，其重要的病理生理學(xué)特征改變是心肌細(xì)胞原發(fā)性損傷會引起結(jié)構(gòu)異常而導(dǎo)致心肌纖維化[1]。研究[2]顯示，Wnt信號通路在心臟發(fā)育與血管生成過程中承擔(dān)重要調(diào)控作用。Wnt信號通路在心臟發(fā)育早期被激活，加速心臟祖細(xì)胞的增殖和遷移，但其活性在心臟發(fā)育晚期則被抑制，促進(jìn)心肌細(xì)胞分化[3]。因此，阻斷Wnt信號通路的異常激活可以在臨床上用作糖尿病心肌纖維化干預(yù)及治療的方法[4]。

藥材丹參首次被記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》里，并在上品之列，它含有眾多化學(xué)成分，其中酚酸類物質(zhì)是主要水溶性成分，為丹參抗心血管疾病的主要活性物質(zhì)。酚酸類化合物具有加強(qiáng)心肌收縮能力、調(diào)節(jié)心臟功能、平衡心肌耗氧量；擴(kuò)張冠狀動脈,增加血流量；防止血小板聚集、抗血栓形成,并影響血液流變學(xué)；改善肝臟微循環(huán)、降低血脂等效果[5-6]。丹參作為活血化瘀之要藥在中醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛使用，但其主要有效成分丹酚酸A作用于心肌纖維化的效果研究不多見。本研究使用由高濃度葡萄糖誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，觀察丹酚酸A對心肌成纖維細(xì)胞中Wnt信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠，出生24 h內(nèi)，雌雄不限(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號11400700012085、11400700016098)。

1.1.2 主要試劑和儀器 標(biāo)準(zhǔn)品丹酚酸A(沈陽藥科大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈送)；卡托普利對照品(中國食品藥品檢定研究院)；美國西格瑪公司進(jìn)口分裝Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶及四氮唑鹽(MTT)；美國貝克曼庫爾特公司DNA PREP試劑盒；美國USCN公司Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原ELISA試劑盒；美國RD公司TGF-β1 ELISA試劑盒；Biogenes公司的小鼠抗結(jié)蛋白單克隆抗體和小鼠抗波形蛋白單克隆抗體；智杰方遠(yuǎn)科技有限公司PVDF膜；Thermo Fisher Scientific公司的ECL發(fā)光液；美國Gibco公司DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)；美國Abcam公司兔抗大鼠-catenin單克隆抗體、兔抗大鼠-GSK-3β單克隆抗體及兔抗大鼠p-GSK-3β單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體和羊抗兔IgG多克隆抗體。美國BD流式細(xì)胞分析儀；美國BioTek酶聯(lián)免疫分析儀；美國Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts CFs)的體外培養(yǎng)和鑒定 采用差速貼壁法，根據(jù)SREEJIT等[7]方法改進(jìn)，在無菌條件下快速剪開在24 h內(nèi)出生的SD大鼠乳鼠胸腔，浸泡在4 ℃ 0.01% 磷酸鹽緩沖液(PBS)中以除去血細(xì)胞，75%乙醇沖洗30 s后剪碎至大小1 mm3，棄掉PBS，加等體積的0.125% 胰蛋白酶和0.1% Ⅱ型膠原酶混合液，37 ℃水浴振動并消化10 min，待組織塊完全消失，收集每次細(xì)胞消化懸液并用10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)液終止消化，2 000 r/min離心10 min，收集消化懸液后傾去上清，加10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基輕輕吹打，制成細(xì)胞懸液接種在培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。鑒于心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時間的差異，60 min時將上清傾去，貼壁者則為CFs，加10% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基以繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)細(xì)胞80%～90%融合，0.25%胰酶繼續(xù)消化傳代(1∶2)，選取2～4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 正常對照組，DMEM低糖培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L D-葡萄糖)；西藥對照組，22 mg/L卡托普利；高滲對照組，DMEM培養(yǎng)基(含5.5 mmol/L D-葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇) ；模型對照組，DMEM高糖培養(yǎng)基(含25 mmol/L D-葡萄糖)；丹酚酸A+高糖組，25、50、100 mg/L丹酚酸A+DMEM高糖培養(yǎng)基(含25 mmol/L D-葡萄糖)。

1.2.3 MTT法檢測CFs增殖能力 將對數(shù)期生長的CFs制備細(xì)胞懸液，以每孔100 μL、密度5×104個/毫升接種到96孔板，培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃，5% CO2孵育24 h無血清DMEM同步化培育24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理再孵育24、48 h，每孔滴10 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄掉上清，每孔加入100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測吸光度值(OD)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CFs的細(xì)胞周期 將CFs細(xì)胞懸液，以每孔2 mL、密度1×105個細(xì)胞/毫升接種到6孔板中，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用無血清DMEM重新同步24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理再孵育48 h。0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，密度調(diào)整為1×106個細(xì)胞/毫升，嚴(yán)格按細(xì)胞DNA PREP周期試劑盒進(jìn)行操作，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的檢測操作，并用 MCYCLE 軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.2.5 ELISA法檢測CFs中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量 取1×105個細(xì)胞/毫升密度的CFs細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種在6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無血清DMEM替換并同步化24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理，培養(yǎng)48 h后分別收集細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量，測量450 nm處OD，并根據(jù)濃度曲線計(jì)算每孔細(xì)胞濃度。

1.2.6 ELISA法檢測CFs中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)蛋白含量 制成的CFs細(xì)胞懸液，測定方法按Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量的方法處理，培養(yǎng)48 h后分別吸出細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定TGF-β1的含量，測量450 nm處OD，并根據(jù)濃度曲線計(jì)算每孔細(xì)胞濃度。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測CFs中β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β的蛋白表達(dá) 細(xì)胞總蛋白的提取：蛋白裂解液加入到分組處理培養(yǎng)后的CFs中，置于冰浴上30 min，裂解物用細(xì)胞刮刀取下，2 000 r/min離心30 min取上清液，蛋白含量于紫外分光光度儀測定，樣本濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，調(diào)節(jié)濃度后，加上樣緩沖液，將蛋白煮沸3 min變性并儲存在于-80 ℃冰箱中。蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：將通過電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并浸于含有5%牛血清白蛋白的TBST室溫封閉液中30 min，再加一抗(1∶500)孵育20 min，4 ℃冰箱中過夜。復(fù)溫后將膜洗滌重復(fù)5次，10分鐘/次，封閉30 min，并用二抗封閉90 min，將膜洗滌重復(fù)5次，10分鐘/次，滴加ECL發(fā)光液，成像分析系統(tǒng)中保存采集曝光圖像。應(yīng)用IMAGE J軟件分析各樣本灰度值，蛋白相對含量為各樣本和相應(yīng)內(nèi)參灰度比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SD乳鼠的CFs培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定 SD大鼠乳鼠心肌CFs在2～3 d會迅速生長成為融合狀態(tài)。細(xì)胞體大，多為細(xì)胞質(zhì)透明的梭形，具有一個卵圓形的核，通常含有1～2個核仁(見圖1、2)，無自發(fā)性搏動。細(xì)胞臺盼蘭染色后細(xì)胞存活率>90% ，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色鑒定Vinentin染色呈陽性，抗原呈紅色(見圖3)；Desmin染色呈陰性(見圖4)者為實(shí)驗(yàn)需要的CFs，細(xì)胞純度為98%。

2.2 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下細(xì)胞增殖的影響CFs 在高濃度葡萄糖條件下培養(yǎng)24、48 h，細(xì)胞的增殖活性均高于正常對照組(P<0.01和P<0.05)(見表1)。高滲對照組細(xì)胞增殖活性與正常對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)CFs增殖(P<0.01)。干預(yù)24 h后，高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞明顯增殖(P<0.01)；與模型對照組相比，用藥組均可明顯抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)，以西藥對照組作用效果最明顯(P<0.01)。干預(yù)48 h后，高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞明顯增殖(P<0.01)；與模型對照組相比，用藥組均可明顯抑制細(xì)胞增殖(P<0.01)，西藥對照組作用效果最明顯(P<0.01)(見表2)。

表1 高濃度葡萄糖在不同時間點(diǎn)對CFs增殖活性的作用

2.3 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下細(xì)胞增殖周期的影響 與正常對照組相比，高濃度葡萄糖可以明顯降低G0+G1期CFs數(shù)量百分比(P<0.01)，明顯增加S+G2+M期CFs數(shù)量百分比(P<0.01)。與模型對照組相比，用藥組能明顯增加G0+G1期CFs數(shù)量百分比(P<0.01)，同時降低S+G2+M期CFs數(shù)量百分比(P<0.01)，且100 mg/L丹酚酸A的作用明顯優(yōu)于50 mg/L丹酚酸A(P<0.01)(見圖5、表3)。

表2 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下細(xì)胞增殖的影響

2.4 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原含量的影響 與正常對照組相比，高濃度葡萄糖可以明顯誘導(dǎo)CFs分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原(P<0.01)。與模型對照組相比，丹酚酸A各濃度組均能抑制CFs Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的分泌(P<0.05～P<0.01)，西藥對照組對Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原分泌沒有明顯影響(P>0.05)(見表4)。

2.5 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下TGF-β1合成的影響 與正常對照組相比，高濃度葡萄糖糖可以明顯誘導(dǎo)CFs合成TGF-β1(P<0.01)。與模型對照組相比，100、50 mg/L丹酚酸A及西藥對照組能明顯抑制TGF-β1的合成(P<0.01)(見表5)。

2.6 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下Wnt信號通路蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組相比，高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)CFs中β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，且明顯下調(diào)p-GSK-3β的表達(dá)(P<0.01)。與模型對照組比較，用藥組均可明顯抑制β-catenin的表達(dá)(P<0.01)，100 mg/L丹酚酸A可以上調(diào)p-GSK-3β的表達(dá)(P<0.05)(見表6)。

3 討論

中藥丹參為多年生草本植物丹參的根，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草匯言》《山東中草藥手冊》等有關(guān)丹參的古籍載錄，丹參味苦、性微寒，可祛瘀而生新,雖行但不破,可補(bǔ)可散,起活血、止痛、化瘀、養(yǎng)血、生血等作用,且療效甚顯[8-11]。臨床上中醫(yī)廣泛用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)代研究[12]發(fā)現(xiàn)丹參具有保護(hù)腦、器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及調(diào)節(jié)免疫力、抗菌抗炎和抗腫瘤的作用，活性成分丹參酮及丹酚酸類是丹參藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

心肌纖維化是形成纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)器，CFs具有分泌功能，在心臟正常生長時和病理性重塑中肩負(fù)重要作用[12]。心肌纖維化的病理基礎(chǔ)為心肌間質(zhì)含量所占心肌組織比例增加[13]，是DCM病理組織學(xué)變化表現(xiàn)之一，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞數(shù)量的增加，心肌組織中膠原過度的沉積進(jìn)而引發(fā)的心室順應(yīng)性降低，當(dāng)舒張功能和收縮功能和受損后，最終會惡化為心力衰竭[14]。

Wnt信號通路異常調(diào)控發(fā)生時，可限制心肌細(xì)胞分化，導(dǎo)致心臟體積變小，阻礙形成分化成心臟的中胚層，影響胚胎心臟發(fā)育，誘發(fā)纖維增生等疾病[15-17]。β-catenin是Wnt/β-catenin連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心分子，且Wnt信號通路在機(jī)體正常條件下處于靜默狀態(tài)，GSK-3β復(fù)合物磷酸化的β-catenin會因?yàn)榉核氐鞍酌缸R別并降解作用維持在較低水平表達(dá)狀態(tài)。但當(dāng)信號通路活化后，GSK-3β則會脫離降解復(fù)合體，使復(fù)合物的形成被抑制，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin積累而后進(jìn)入細(xì)胞核并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄[18]。本實(shí)驗(yàn)CFs中Wnt信號通路經(jīng)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)異常激活，β-catenin蛋白表達(dá)明顯升高，p-GSK-3β的表達(dá)明顯下調(diào)。

表3 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下細(xì)胞增殖周期的影響

表4 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原分泌的影響

表5 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下TGF-β1合成的影響

表6 丹酚酸A對CFs在高濃度葡萄糖培養(yǎng)下Wnt信號通路蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1為促進(jìn)心肌纖維化形成和發(fā)展的主要細(xì)胞因子，并可通過自分泌和旁分泌途徑促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，增加以膠原為主的間質(zhì)蛋白的合成，也可以促進(jìn)損傷修復(fù)和抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，在形成組織器官纖維化的過程中發(fā)揮了作用[19-20]。TGF-β1信號轉(zhuǎn)到通路同時也是各種因素致心肌纖維化的共同通路。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)高濃度葡萄糖糖誘導(dǎo)的CFs促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞的增殖，TGF-β1合成增加。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖培養(yǎng)的CFs用丹酚酸A干預(yù)后抑制細(xì)胞增殖效果明顯，S期細(xì)胞數(shù)量百分比降低明顯，表明其干預(yù)下能顯著抑制CFs增殖，減少CFs數(shù)量，并且延緩糖尿病心肌纖維化的發(fā)展。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的分泌還能被其降低，推斷丹酚酸A可以抑制CFs增殖的同時，還能夠降低膠的原合成與分泌能力，繼而推遲了糖尿病心肌纖維化的發(fā)展。在分子水平上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)β-catenin和TGF-β1的高表達(dá)并下調(diào)p-GSK-3β的表達(dá)，且丹酚酸A能抑制β-catenin表達(dá)、上調(diào)p-GSK-3β的表達(dá)，表明丹酚酸A能夠阻斷WNT/β-catenin信號轉(zhuǎn)到通路的異常激活；TGF-β1蛋白的表達(dá)水平同時被丹酚酸A抑制，表明丹酚酸A與TGF-β信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)也存在相應(yīng)的作用關(guān)系。在高糖環(huán)境中Wnt信號通路與TGF-β信號通路關(guān)鍵分子的變化指向兩種途徑之間可能存在協(xié)同作用。

綜上，丹酚酸A抑制CFs在高濃度葡萄糖中的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞周期S期的增殖，降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和TGF-β1的分泌，同時能夠干預(yù)Wnt信號通路的異常表達(dá)。提示丹酚酸A是治療糖尿病心肌纖維化的潛在有效成分，其深入的作用機(jī)制值得研究，本研究為中醫(yī)藥防治糖尿病MF研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。