方 典，梁 歡，王佳慧，汪敬業(yè)，李正紅，高 琴

腦卒中病人數(shù)正在逐年上漲，其嚴重的后遺癥極大地影響了病人的生存質(zhì)量[1]。缺血性腦卒中相對于腦出血發(fā)病率更高，在臨床上也更為常見[2]。腦卒中常見的治療方法是通過溶栓或機械再通來恢復(fù)腦部的血流供應(yīng)，這也是拯救有活力的腦細胞的第一步，但疏通血管、恢復(fù)血流后可能會加重之前缺血的損傷，稱為腦缺血再灌注損傷(ischemia and reperfusion injury，I/R)[3]。腦卒中發(fā)生時伴有炎癥產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)亦會加速腦卒中的進展。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體是介導(dǎo)缺血/再灌注后炎癥反應(yīng)的重要靶向蛋白[4]。NLRP3屬于NLRs家族蛋白，在小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞、內(nèi)皮細胞等神經(jīng)元細胞內(nèi)存在不同程度表達[5-7]，能夠被高糖、高脂、炎癥因子、氧化應(yīng)激等致病要素所激活，NLRP3被激活后與caspase-1前體和凋亡相關(guān)斑點樣蛋白共同構(gòu)成了炎癥小體，隨后被活化切割的caspase-1會招募活化更多的白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-18[8]，進一步加重了炎癥反應(yīng)[9]。乙醛脫氫酶2(ALDH2)作為線粒體中的關(guān)鍵酶蛋白[10]，具有清除4-羥基壬烯醛(4-HNE)的作用，同時ALDH2可抑制NLRP3炎癥小體的生成[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，ALDH2的活性下降后，大鼠的神經(jīng)功能受損，腦梗死面積增加，加重了缺血再灌注對腦神經(jīng)的損傷。ALDH2過表達可以減輕心肌細胞纖維化，減少炎癥因子的生成，從而對心肌起到保護作用[13]。通過激活A(yù)LDH2在腦神經(jīng)元中的表達是否可抑制神經(jīng)元炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護作用，目前相關(guān)報道較少。Bax介導(dǎo)的細胞色素c釋放抑制劑(Bax channel blocker，Bcb)通過調(diào)控Bax通道抑制細胞色素c從線粒體釋放，常作為凋亡抑制劑用于減輕細胞凋亡的發(fā)生[14-15]。抑制線粒體細胞色素c釋放是否可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)改變I/R，Bcb是否可調(diào)控腦組織ALDH2的表達目前鮮見報道。

本研究擬通過給予Bcb和ALDH2激動劑，觀察此法干預(yù)對大鼠全腦I/R產(chǎn)生的作用，分析線粒體色素c釋放抑制劑在調(diào)控線粒體ALDH2和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的保護作用?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠體質(zhì)量280～320 g，購于濟南鵬悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號SCXK(魯)20190003。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫控制在(25±1)℃，保持環(huán)境整潔，空氣相對濕潤，光線可自動控制，12 h明暗交替，給予充足的飲食、飲水。

1.2 藥品與試劑 ALDH2激動劑Alda-1及Bcb均購于APEX BIO。NLRP3抗體購于Affinity公司，4-HNE和ALDH2抗體購于Abcam公司；IL-1β和IL-18抗體購于R&D System公司。

1.3 大鼠全腦I/R模型建立及分組 參照Pulsinelli的四血管阻斷法[16-17]模擬全腦缺血再灌注情況造模。大鼠于造模前12 h禁止進食和飲水，準(zhǔn)備造模所需手術(shù)器械，腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉成功后將大鼠固定于立體定位儀上，頭部無偏移，剃毛消毒，確定位置在背后頸部做正中切口，玻璃分針分離第一頸椎，確定橫突翼后，找到雙側(cè)橫突孔位置，將加溫至灼熱的電烙鐵頭(直徑0.5 mm)與切面成45°插入翼狀孔，深度為2～3 mm，電凝雙側(cè)椎動脈5 s，以造成永久性閉塞。用手術(shù)線縫合，消毒。取下大鼠以仰臥位放置，剃毛消毒，在頸部正中做切口，分離雙側(cè)頸總動脈，埋線后縫合切口。結(jié)束后將大鼠放置于恒溫箱恢復(fù)24 h。次日用棉球蘸取少許異氟烷，于密封箱內(nèi)進行麻醉，仰臥位打開頸部切口，用動脈夾夾閉雙側(cè)頸動脈實施大鼠的全腦缺血，在20 min后取下動脈夾恢復(fù)腦部血流供應(yīng)。術(shù)中大鼠的肛溫控制在(37±0.5)℃。大鼠腦缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)是瞳孔放大、發(fā)白，四肢伸直無蘇醒表現(xiàn)。術(shù)中癲癇發(fā)作、狀況不良的大鼠去除。

將大鼠共分4組，每組12只。假手術(shù)組(Sham組)：大鼠封閉椎動脈，不夾閉雙側(cè)頸動脈，缺血前1 h側(cè)腦室注射6 μL 0.9%氯化鈉溶液；缺血再灌注組(I/R組)：缺血前1 h側(cè)腦室注射6 μL 0.9%氯化鈉溶液，缺血20 min后恢復(fù)腦部血流供應(yīng)；Alda-1+I/R組：缺血前1 h給予6 mL Alda-1(10 mg/mL)[18]側(cè)腦室注射，全腦缺血20 min后恢復(fù)腦血流；Bcb+I/R組：缺血前1 h給予6 μL Bcb(20 mg/mL)側(cè)腦室注射，全腦缺血20 min后恢復(fù)腦血流。采用側(cè)腦室給藥觀察藥物對大鼠腦I/R的影響。通過腦立體定位儀，固定大鼠，剃去毛發(fā)后在頭頂正中做切口暴露顱骨確定好前囟位置。在前囟后側(cè)0.92 mm，右側(cè)1.5 mm用小型顱骨鉆鉆孔，微量進針器進針深3.5 mm。相應(yīng)組別大鼠于缺血前1 h側(cè)腦室分別注射相關(guān)藥物，注射速度0.5 μL/min。注射完畢后停針5 min后將進針器緩慢拔出，縫合切口。

1.4 石蠟切片制備及HE染色 每組選取8只大鼠，7 d后，4%水合氯醛麻醉，昏迷后固定好大鼠四肢，剪開胸腔暴露心臟，將灌注針插入大鼠左心室，注入200 mL PBS溶液灌流直至大鼠眼球發(fā)白，再用200 mL 4%多聚甲醛灌流至大鼠四肢僵硬后，斷頭取腦，取視交叉后1～5 mm的冠狀切片，取下的新鮮腦組織用組織固定液固定，48 h后梯度乙醇脫水，后放入透明劑二甲苯中透明，石蠟包埋，將組織蠟塊放入切片機上，在海馬平面行連續(xù)冠狀切片，厚度約3 mm，在蠟塊上做好編號。HE染色后的切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)海馬CA1區(qū)每毫米長度內(nèi)存活的神經(jīng)元數(shù)量，計算存活神經(jīng)元與總細胞的比例。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測海馬CA1區(qū)NLRP3和ALDH2蛋白表達 取I/R 7 d的石蠟標(biāo)本，脫蠟后再放入不同濃度乙醇中水化每次10 min，清水沖洗5 min，PBS沖洗后，80%甲醇孵育10 min，枸櫞酸緩沖液在微波爐里加熱至沸騰后將玻片放入10 min，等待自然冷卻后PBS沖洗，重復(fù)一次待到冷卻到室溫。PBS沖洗2次，每次5 min。加入血清封閉液，室溫孵育20 min后分別滴加一抗：NLRP3(1∶50～1∶200)和ALDH2(1∶50～1∶100)，室溫靜置1 h后PBS沖洗3次，每次5 min。滴加二抗，PBS溶液沖洗3次，每次10 min，DAB顯色10 min，在顯微鏡下觀察確保染色成功后，雙蒸水沖洗10 min終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，流水沖洗10～15 min，最后用二甲苯脫蠟，中性樹脂封片。用CaseViewer2.4軟件打開后選取大鼠的海馬區(qū)域200倍成像，保證背景一致無偏差。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析，統(tǒng)一以像素面積pixel作為標(biāo)準(zhǔn)單位，分別測量每張切片中3個視野陽性的累積吸光度值。

1.6 Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達 取每組4只大鼠的腦組織，大鼠在I/R 48 h后麻醉斷頭，放在冰面上快速分離海馬CA1區(qū)，剪刀剪碎組織后加入適量的組織蛋白裂解液及適量PMSF蛋白酶抑制劑，后用勻漿器冰上研磨，冰上靜置30 min后4 ℃ 14 000 g離心15 min后吸取上清液，提好的組織蛋白分裝標(biāo)記放入-80 ℃保存。采取BCA蛋白測定試劑盒來檢測細胞總蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉結(jié)束后加入一抗稀釋液ALDH2(1∶6 000)、4-HNE(1∶3 000)、NLRP3(1∶500)、IL-1β(1∶1 000)、IL-18(1∶1 000)，4 ℃條件下孵育24 h，加入TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，加入TBST清洗 3次，每次10 min。滴加ECL化學(xué)發(fā)光級，曝光，顯影，用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Alda-1及Bcb對大鼠腦I/R后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的影響 HE染色結(jié)果表明，Sham組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，細胞核為圓形或橢圓形。核膜核仁結(jié)構(gòu)完整，明顯，細胞質(zhì)體積較小，呈淡紅色。與Sham組比較，I/R組再灌注7 d后，神經(jīng)元細胞排列散亂，細胞核固縮深染，海馬CA1區(qū)界限不明顯，神經(jīng)元的存活率明顯下降(見圖1)。與I/R組比較，Alda-1+I/R組、Bcb+I/R組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活率提高(P<0.01)(見表1)。

表1 各組大鼠腦I/R后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活率的比較

2.2 免疫組織化學(xué)海馬CA1區(qū)NLRP3和ALDH2蛋白變化比較 與Sham組比較，I/R組7 d后，海馬CA1區(qū)組織中NLRP3棕黃色陽性染色明顯加深，ALDH2棕黃色陽性染色明顯減弱，提示NLRP3蛋白表達增加，ALDH2蛋白表達下降(見圖2)。與I/R組比較，Alda-1+I/R組、Bcb+I/R組海馬CA1區(qū)組織中NLRP3蛋白表達下降，ALDH2蛋白表達增加(P<0.01)(見表2)。

2.3 Western blotting顯示炎癥小體相關(guān)蛋白變化 Western blotting結(jié)果顯示，與Sham組對比，腦I/R 48 h后海馬CA1區(qū)NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白表達增加(P<0.01)；與I/R組相比，Alda-1+I/R組、Bcb+I/R組的海馬CA1區(qū)NLRP3、IL-1β、IL-18蛋白表達減少(P<0.01)，提示激動ALDH2、抑制線粒體細胞色素c釋放均可引起NLRP3炎癥小體和相繼的炎癥反應(yīng)減輕(見圖3、表3)。

表2 各組大鼠腦I/R后海馬CA1區(qū)NLRP3和ALDH2蛋白吸光度變化的比較

3 討論

腦I/R是一個常見的器官血流中斷后再灌注的損傷過程[19]。缺氧條件下，海馬組織是腦缺血缺氧易損傷區(qū)域[20]。本研究中，腦缺血再灌注7 d的HE染色結(jié)果顯示，海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元死亡的細胞明顯增多，提示全腦I/R會導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生損傷。

近年來，越來越多的證據(jù)表明炎癥小體的激活可能導(dǎo)致腦缺血期間神經(jīng)元死亡[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與神經(jīng)系統(tǒng)的疾病存在一定的關(guān)聯(lián)，當(dāng)NLRP3炎癥小體被激活后，活化的caspase-1會導(dǎo)致促炎性細胞因子IL-1β、IL-18的激活，進一步損傷組織器官。本研究中，我們觀察到在大鼠全腦I/R 48 h后，海馬CA1區(qū)組織中炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3及下游的IL-1β及IL-18蛋白表達增多，進一步采用免疫組織化學(xué)觀察到腦I/R 7 d后海馬CA1區(qū)NLRP3的陽性染色增多，提示全腦I/R后NLRP3持續(xù)存在。

表3 各組大鼠腦I/R后海馬CA1區(qū)炎癥小體相關(guān)蛋白灰度值比較

線粒體膜脂質(zhì)參與維持線粒體膜的完整及保障線粒體的正常功能，而活性氧的產(chǎn)生主要也是來源于線粒體[23]。在大鼠局灶性腦I/R損傷模型中，Alda-1處理后可抑制I/R導(dǎo)的腦細胞凋亡的發(fā)生及4-HNE、MDA水平的升高[24]。此外，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在全腦I/R 48 h過后大鼠海馬CA1區(qū)組織中ALDH2蛋白表達降低的同時4-HNE蛋白表達增加，提示全腦I/R引起的細胞損傷還可能與ALDH2減少、醛類代謝產(chǎn)物4-HNE增加等有關(guān)。

有研究[25]發(fā)現(xiàn)，在短暫性腦缺血再灌注模型中，通過Bcb的干預(yù)可減輕缺血再灌注過程中對腦細胞的損傷，減少Ca2+堆積、抑制活性氧的生成。我們選擇Bcb以及激動ALDH2的Alda-1分析對腦缺血再灌注的影響及分析相互聯(lián)系。HE染色結(jié)果顯示通過Alda-1激動ALDH2及Bcb均明顯提高了海馬CA1區(qū)的細胞存活率。Western blotting結(jié)果表明，Alda-1和Bcb顯著上調(diào)了大鼠海馬CA1區(qū)細胞內(nèi)ALDH2蛋白水平，降低了4-HNE、NLRP3及炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-18的蛋白水平，提示激動ALDH2和抑制細胞色素c均可通過抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護作用。

本研究中我們還觀察到，Bcb能促進ALDH2的表達、抑制炎癥小體關(guān)鍵蛋白NLRP3的生成和炎癥因子的釋放，而激動ALDH2亦能抑制NLRP3的表達，提示Bcb可能通過促進ALDH2的表達減少NLRP3的釋放，減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護作用，其相關(guān)的機制需要我們進一步深入探索。

綜上所述，Bcb可能通過增加ALDH2的表達、抑制NLRP3的生成減輕全腦I/R中炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護作用。