趙小秋 崔婉婷

羊水細(xì)胞嵌合體是指在同一份羊水標(biāo)本中同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種及兩種以上核型，是產(chǎn)前診斷過(guò)程中一種常見(jiàn)結(jié)果。按照目前通用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，可將羊水細(xì)胞嵌合體分為三個(gè)級(jí)別：Ⅰ級(jí)：僅在一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)異常核型，此種情況大多數(shù)均為人為因素造成的假性嵌合；Ⅱ級(jí)：僅在一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)及兩個(gè)以上異常核型，該情況往往需結(jié)合其他培養(yǎng)瓶培養(yǎng)結(jié)果或其它檢查進(jìn)行判定，而且大多數(shù)情況也均為假性嵌合；Ⅲ級(jí)：在兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)均發(fā)現(xiàn)同樣的異常核型，該情況大多數(shù)為胎兒的真性嵌合[1]。染色體嵌合體真?zhèn)蔚呐卸搬槍?duì)該結(jié)果的遺傳咨詢?cè)诋a(chǎn)前診斷中至關(guān)重要，是決定妊娠結(jié)局的重要依據(jù)。目前針對(duì)產(chǎn)前診斷嵌合體結(jié)果的遺傳咨詢，尤其是有關(guān)染色體嵌合體的致病性的研究仍需大量病例的積累。本研究將針對(duì)205例羊水細(xì)胞嵌合體的產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局進(jìn)行分析，以期為產(chǎn)前診斷結(jié)果中染色體嵌合的相關(guān)解釋提供參考。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2018年1月至2019年11月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科205例羊水細(xì)胞嵌合體核型結(jié)果。

二、方法：

1.研究方法：對(duì)羊水細(xì)胞核型結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，查找其核型復(fù)查結(jié)果和CNV-seq (copy number variations sequencing)檢測(cè)結(jié)果；并對(duì)其中部分病例進(jìn)行妊娠結(jié)局的回訪，內(nèi)容包括孕婦是否選擇終止妊娠；若選擇繼續(xù)妊娠，胎兒出生后表型是否正常。

2. 診斷標(biāo)準(zhǔn)：本實(shí)驗(yàn)室羊水核型計(jì)數(shù)和診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部《2010年胎兒染色體異常的細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)》。I級(jí)嵌合體(level I)：異常核型只出現(xiàn)在來(lái)自單個(gè)培養(yǎng)瓶的單個(gè)核型(single cell single flask, SC)；Ⅱ級(jí)嵌合體(level Ⅱ)：在同一培養(yǎng)瓶中檢出兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的異常核型 (multiple cells single flask, MC)；Ⅲ級(jí)嵌合體(level Ⅲ)：在兩個(gè)或兩個(gè)以上培養(yǎng)瓶中，檢出兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的異常核型。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將嵌合體結(jié)果輸入EXCEL 2013表格建立數(shù)據(jù)庫(kù)，分類后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)資料用構(gòu)成比和率表示。

結(jié) 果

1. 嵌合體發(fā)生率

本研究對(duì)7225例羊水細(xì)胞核型結(jié)果進(jìn)行回顧，共發(fā)現(xiàn)205例嵌合體，其發(fā)生率為2.8%。

2.嵌合體分類

將205例嵌合體分為以下五類：(1)常染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合；(2)性染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合；(3)標(biāo)記染色體嵌合；(4)常染色體數(shù)目異常嵌合；(5)性染色體數(shù)目異常嵌合。將每一類嵌合體按級(jí)別分類統(tǒng)計(jì)，并回顧其核型復(fù)查結(jié)果和CNV-seq檢測(cè)結(jié)果(表1)。在205例嵌合體中，Ⅰ級(jí)嵌合為153例，占比最多(74.6%)；Ⅲ級(jí)嵌合為34例，占比16.6%；Ⅱ級(jí)嵌合為18例，占比最少(8.8%)。Ⅰ級(jí)嵌合結(jié)果中，大多數(shù)為常染色體數(shù)目嵌合(102例)，9例常染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合均為Ⅰ級(jí)嵌合；Ⅱ級(jí)嵌合結(jié)果中多數(shù)為性染色體數(shù)目異常嵌合(10例)，其次為染色體數(shù)目異常嵌合(7例)；Ⅲ級(jí)嵌合結(jié)果中，大多數(shù)為性染色體數(shù)目異常嵌合(25例)，其次為常染色體數(shù)目異常嵌合(8例)。

表1 205例嵌合體遺傳學(xué)檢查結(jié)果

3. 核型分析結(jié)果

在205例病例中，共有20例患者選擇重新采取羊水或臍血標(biāo)本進(jìn)行核型分析。其中14例Ⅰ級(jí)和3例Ⅱ級(jí)嵌合病例的核型復(fù)查結(jié)果為正常核型；1例Ⅱ級(jí)常染色體數(shù)目嵌合病例(47,XN,+9[2](MC)/46,XN[49])復(fù)查結(jié)果為Ⅲ級(jí)嵌合(47,XN,+9[5]/46,XN[40])；2例Ⅲ級(jí)性染色體數(shù)目嵌合病例(45,X[2]/46,XY[28]和46,XX[2]/46,XY[48])復(fù)查后均為正常核型，未顯示嵌合。

4. CNV-seq檢測(cè)

在205例病例中，有76例孕婦選擇CNV-seq檢測(cè)。其中，CNV-seq在53例Ⅰ級(jí)嵌合病例中均未檢測(cè)到嵌合。將23例Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)嵌合病例的核型結(jié)果與其CNV-seq檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比(表2)，發(fā)現(xiàn)9例CNV-seq檢測(cè)到的嵌合比例與核型嵌合比例不能完全一致；在3例Ⅲ級(jí)嵌合病例中，CNV-seq檢測(cè)到的性染色體異常嵌合類型與核型結(jié)果不完全一致；6例Ⅱ級(jí)嵌合病例及5例Ⅲ級(jí)性染色體異常嵌合的CNV-seq檢測(cè)結(jié)果未顯示嵌合。

表2 羊水細(xì)胞Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)嵌合核型結(jié)果與CNV-seq結(jié)果比對(duì)

5. 妊娠結(jié)局隨訪

對(duì)Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)嵌合病例的妊娠結(jié)局進(jìn)行回訪(表3)，結(jié)果為在25例Ⅲ級(jí)性染色體異常嵌合核型中，18例孕婦選擇引產(chǎn)，5例選擇正常分娩，2例失訪。有3例性染色體異常Ⅲ級(jí)嵌合的病例分別僅在兩個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)計(jì)數(shù)到1個(gè)45,X細(xì)胞(45,X[2]/46,XN)，其后均分娩表型無(wú)異常的健康嬰兒；1例核型為46,XX[2]/46,XY[48]，復(fù)查結(jié)果為46,XY，后正常分娩健康嬰兒。另有1例核型為47,XYY[6]/46,XY[34]的孕婦選擇正常分娩，新生兒表型無(wú)異常。10例Ⅱ級(jí)性染色體異常嵌合核型中，7例分娩表型無(wú)異常的健康嬰兒；3例選擇引產(chǎn)，依據(jù)為超聲異常，而非染色體異常。在7例Ⅱ級(jí)常染色體嵌合核型中，1例核型結(jié)果為47,XN,+18[3](MC)/46,XN[84]的病例，其CNV-seq結(jié)果也提示18-三體嵌合；還有1例復(fù)查后為9號(hào)染色體三體嵌合且級(jí)別為Ⅲ級(jí)，此兩例均選擇引產(chǎn)；其余5例均分娩了健康嬰兒。在8例Ⅲ級(jí)常染色體嵌合核型中，有6例嵌合型21-三體，1例嵌合型18-三體，1例為48,XXY,+18/47,XXY，以上8例病例均選擇引產(chǎn)。

表3 羊水細(xì)胞Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)嵌合的妊娠結(jié)局

討 論

染色體嵌合體是產(chǎn)前診斷中的常見(jiàn)現(xiàn)象。本研究顯示嵌合體發(fā)生的比率為2.8%(205/7225)。其中Ⅰ級(jí)嵌合所占比例最大，即假性嵌合較多，可能與本實(shí)驗(yàn)室目前采取的傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶法來(lái)收獲羊水細(xì)胞有關(guān)。由于培養(yǎng)瓶法需手動(dòng)將瓶壁上的細(xì)胞刮下，容易人為造成染色體斷裂、易位等。在制片過(guò)程中不斷地吹打液體，也有可能造成染色體數(shù)目異常的假性嵌合。而改進(jìn)的原位培養(yǎng)法能較好的保持染色體的完整性，更好地來(lái)辨認(rèn)染色體嵌合的真?zhèn)蝃2]。因此，必要時(shí)應(yīng)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，盡量減少假性嵌合給孕婦帶來(lái)不必要的焦慮。

在所有染色體中，21、18和性染色體易形成非整倍體，且其異常胚胎存活的幾率相對(duì)較高，其他染色體異常的胚胎基本都在早期流產(chǎn)，基本不能存活至孕中期[3]。故在本研究的Ⅲ級(jí)嵌合病例中，性染色體異常嵌合病例占比最高，常染色體嵌合核型中也絕大多數(shù)為21-三體嵌合，其次為18-三體，基本沒(méi)有其他染色體三體。另外，性染色體嵌合形式存在多樣，不僅有數(shù)目異常嵌合，也有結(jié)構(gòu)異常嵌合，且絕大多數(shù)性染色體嵌合的核型中都包括45,X。這是由于在分裂錯(cuò)誤產(chǎn)生的單體細(xì)胞中，X染色體單體是唯一可存活的細(xì)胞，而常染色體單體細(xì)胞基本沒(méi)有存活的可能[4]，故在羊水細(xì)胞的嵌合體中只能發(fā)現(xiàn)X染色體單體。另有研究表明，X染色體單體往往需同時(shí)伴有X二體時(shí)個(gè)體才可存活，Turner綜合征患者的某些組織中也通常會(huì)存在X染色體二體[5]。另外，染色體非整倍體與嵌合體的形成機(jī)制不盡相同。非整倍體的發(fā)生機(jī)制多為形成配子的減數(shù)分裂過(guò)程中染色體不分離，與孕婦高齡密切相關(guān)[6]。而嵌合型染色體數(shù)目異常多發(fā)生在處于受精卵有絲分裂后期的卵裂期，甚至可在囊胚形成期，且其多與有絲分裂后期遲滯相關(guān)[7,8]；而且有研究認(rèn)為染色體嵌合體是受精卵分裂發(fā)育過(guò)程中的一種病理現(xiàn)象，與孕婦的年齡無(wú)關(guān)[9]。

在本研究中，因部分患者參考CNV-seq結(jié)果直接選擇繼續(xù)妊娠或引產(chǎn)，而且Ⅰ級(jí)和Ⅲ級(jí)嵌合的真?zhèn)位究梢耘卸?，孕婦遺傳咨詢后也會(huì)據(jù)此直接選擇妊娠結(jié)局，不愿承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)再次取樣，故孕婦自主選擇采取臍血樣品來(lái)進(jìn)行復(fù)查的比例不高。通過(guò)對(duì)比核型結(jié)果和CNV-seq檢測(cè)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，Ⅰ級(jí)嵌合的復(fù)查和CNV-seq檢測(cè)結(jié)果均未提示嵌合體，也說(shuō)明Ⅰ級(jí)嵌合多為假性嵌合，與國(guó)際公認(rèn)觀點(diǎn)基本保持一致。在Ⅱ級(jí)嵌合病例中，有1例核型為47,XN,+18[3](MC)/46,XN[84]的病例，其CNV-seq結(jié)果提示18-三體嵌合；另1例47,XN,+9[2](MC)/46,XN[49]復(fù)查后為47,XN,+9[5]/46,XN[40]。盡管常規(guī)觀點(diǎn)認(rèn)為Ⅱ級(jí)嵌合多為假性嵌合，但本研究中仍出現(xiàn)兩個(gè)Ⅱ級(jí)嵌合病例為真性嵌合的病例，提示在Ⅱ級(jí)嵌合病例的遺傳咨詢時(shí)，應(yīng)結(jié)合其它檢查方法進(jìn)行綜合評(píng)估。

在Ⅲ級(jí)嵌合病例中，多數(shù)病例的胎兒核型和CNV-seq結(jié)果都有一定的差異。首先，兩者檢測(cè)到的嵌合比例不太一致，其原因一是可能由于核型結(jié)果中計(jì)數(shù)細(xì)胞太少，不足以代表胎兒核型全貌，而CNV-seq則是對(duì)胎兒羊水細(xì)胞DNA進(jìn)行整體測(cè)序，兩種方法所采取樣本的量并不在一個(gè)量級(jí)水平上，所以嵌合比例會(huì)有所差異；另外一個(gè)原因是羊水核型所采用的標(biāo)本為人工培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞。羊水細(xì)胞來(lái)源多樣，除胎兒呼吸道、泌尿道、消化道脫落的上皮細(xì)胞外，還包括羊膜腔上皮細(xì)胞[10]，有些細(xì)胞可能不適用于經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的人工培養(yǎng)，所以培養(yǎng)后的羊水細(xì)胞和未培養(yǎng)的羊水細(xì)胞的嵌合比例會(huì)有區(qū)別[11]，之前所述的Ⅱ級(jí)嵌合病例為真性嵌合也可能與之有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)性染色體嵌合時(shí)，核型結(jié)果與CNV-seq結(jié)果的區(qū)別更大，除嵌合比例不同外，檢測(cè)到染色體異常的類型也不一致，這可能與CNV-seq技術(shù)的原理有關(guān)。CNV-seq技術(shù)是通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得出染色體的拷貝數(shù)[12]，只能根據(jù)拷貝數(shù)判定出X染色體的異常比例，而無(wú)法判斷其異常類型。更有甚者，如核型為45,X/47,XXX/46,XX的嵌合體，其CNV-seq結(jié)果中的X染色體的整體拷貝數(shù)與正常女性的拷貝數(shù)并無(wú)太大差異，其結(jié)果還是在2左右，不能顯示出X染色體存在嵌合型異常。另外1例核型結(jié)果為45,X[39]/46,X,der(Y;Y;Y)(qter→p11.3::p11.3→q12::q11.2→qter)[4]，其CNV-seq結(jié)果并未提示嵌合體，且X、Y染色體拷貝數(shù)均為1(圖1)。因此，由于技術(shù)的限制，CNV-seq可能會(huì)漏診某些類型的性染色體異常嵌合，不能完全替代傳統(tǒng)的核型檢查，兩者結(jié)合起來(lái)可提高染色體異常的檢出率[13]。

圖1 性染色體異常嵌合體的核型和CNV-seq結(jié)果

在產(chǎn)前診斷結(jié)果中有關(guān)嵌合體的遺傳咨詢時(shí)，一般認(rèn)為，若常染色體三體嵌合，胎兒異常的風(fēng)險(xiǎn)較高，而性染色體異常嵌合有可能不會(huì)影響智力發(fā)育和表型。而且由于細(xì)胞分裂錯(cuò)誤會(huì)發(fā)生在胚胎發(fā)育過(guò)程的不同時(shí)期，其產(chǎn)生的細(xì)胞系嵌合會(huì)存在于不同的組織和器官中，導(dǎo)致個(gè)體癥狀也不盡相同[9,14]，這時(shí)需把風(fēng)險(xiǎn)充分告知給孕婦，讓其做知情選擇。總之，在產(chǎn)前診斷過(guò)程中，應(yīng)改進(jìn)并采取多種實(shí)驗(yàn)方法來(lái)提高染色體嵌合體的診斷準(zhǔn)確率[15]，并配合規(guī)范的遺傳咨詢建議，盡量為患者提供良好的產(chǎn)前診斷服務(wù)。