陳沙 李榮慧 吳結(jié)枝 曹寶丹 田國力 劉平安 張國民

湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(primary osteoporosis，POP)中的I型[1]，PMOP其病位在骨，以疼痛為主要癥狀，可歸類為中醫(yī)的骨痹范疇[2]。根據(jù)國家統(tǒng)計局調(diào)查顯示[3]，我國65歲以上人口約為1.4億，是世界上老年人口絕對數(shù)最多的國家。預計到2050年，中國大陸骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生率將達599萬例/年，相應的醫(yī)療費用高達約254億美元[4]，骨質(zhì)疏松癥將成為我國重要的公共健康問題之一。自噬是近年研究的熱點，屬于真核細胞的一種“自食”現(xiàn)象，是細胞特有的自我保護機制[5]。有學者[6]將細胞自噬與中醫(yī)氣虛時“精化氣”的功能對比，氣虛時，精可化氣，以維持內(nèi)環(huán)境陰陽平衡。認為細胞自噬與機體轉(zhuǎn)化、消除內(nèi)生痰濁瘀血實邪的功能息息相關(guān)，一旦調(diào)節(jié)失衡則可導致PMOP等疾病。目前，壯骨止痛膠囊對骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的作用機制尚未明確。本研究以去卵巢大鼠為研究對象，探索壯骨止痛膠囊調(diào)控自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62及LC3對去卵巢大鼠BMMSCs增殖與骨向分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：選取SPF級SD雌性大鼠42只，體質(zhì)量190～250 g，6～8周齡，于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)[批號：SCXK(湘)2016-0002]，適應性喂養(yǎng)一周后進行試驗[7]。

1.1.2試劑：壯骨止痛膠囊由補骨脂、淫羊藿、川牛膝、枸杞子、狗脊、女貞子、骨碎補等組成(四川美大康有限公司提供，批號181006，7味藥按3∶3∶2∶2∶2∶2∶2比例配伍)；RAPA(MCE公司，批號38921)；3-MA(MCE公司，批號40214)；低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)(Gibco公司，批號8118374)；FBS胎牛血清(Gibco公司，批號42A0071K)；雙抗(Gibco公司，批號1999384)；Trypsin-EDTA(Gibco公司，批號1868583)；CKK8試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司，批號20190124)；兔抗大鼠LC3抗體(MBL公司，批號034)；兔抗大鼠Beclin-1抗體(Proteintech公司，批號00065068)；兔抗大鼠p62抗體(Proteintech公司，批號00079494)；PPAR-γ試劑盒(上海JINGTIAN公司，批號20190729)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物有限公司，批號20190724)等。

1.2 方法

1.2.1分組及給藥：將實驗動物分為模型組、壯骨止痛膠囊組、雷帕霉素(RAPA)組、3-甲基腺嘌呤(3-MA)組、空白組及假手術(shù)組。模型組采用國內(nèi)外公認的去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型[8-10]，假手術(shù)組摘除卵巢周圍等質(zhì)量脂肪組織，術(shù)后注射青霉素。空白組不做任何處理。術(shù)后6 d對壯骨止痛膠囊組、雷帕霉素(RAPA)組、3-甲基腺嘌呤(3-MA)組灌胃給藥。壯骨止痛膠囊0.45 g/粒，成人劑量12粒/d，按人-大鼠體表面積折算確定大鼠壯骨止痛膠囊高濃度為1.944 g/(kg·d)，RAPA、3-MA溶解在油水比例為4∶6的玉米油中，RAPA濃度為6 mg/kg，3-MA濃度為8 mg/kg，連續(xù)給藥12周。

1.2.2HE染色：給藥周期結(jié)束后，斷頸處死各組大鼠，取左側(cè)后肢用于骨組織HE染色，檢測股骨病理形態(tài)學變化。

1.2.3CKK8法檢測各組BMMSCs的生長曲線及ALP活力：運用全骨髓貼壁法分離原代BMMSCs并培養(yǎng)至P2代，將P2代細胞胰酶消化以后，按2×103個/孔，每孔100 μL接種到96孔板，依次加入空白組、假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛膠囊組、RAPA組和3-MA組細胞懸液，5個復孔。各孔中加入CKK8溶液，4 h后在450 nm波長處進行OD值測定，繪制BMMSCs的生長曲線[7]。按照微孔板法ALP試劑盒說明書測定ALP活力：將P2代BMMSCs懸液濃度配制為1×105個/mL，將1 mL細胞接種在24孔板中進行無菌培養(yǎng)，第3天換液，第7天棄掉上層完培，用PBS溶液清洗3次，最后一次清洗完成后在24孔板中依次加入1% Triton X-100 100 μL，冰上裂解30 min。收集裂解液，進行ALP活力的測定。

1.2.4免疫組化分析股骨中Beclin1、LC3及p62蛋白的表達：將修整好的左側(cè)股骨蠟塊取出，經(jīng)脫蠟，水化，滅活，冷修復，滴加一抗(比例1∶100，4 ℃過夜)，清洗(洗液為PBS，3次，3 min/次)，滴加反應增強液(37 ℃，40 min)，清洗，滴加二抗(37 ℃，40 min)，清洗，DAB顯色，流水沖洗，復染，烘干(60 ℃，3 min)，放置過夜，封片觀察。陽性反應區(qū)域為棕黃色，北航MIAS圖像分析Beclin1、LC3及p62蛋白的平均灰度值進行比較分析。

1.2.5ELISA檢測血清PPAR-γ表達：末次灌胃給藥后第二天取材，做好動物取材前期準備工作。大鼠麻醉固定，腹主動脈取血。按照雙抗體夾心技術(shù)對大鼠血清PPAR-γ進行酶聯(lián)免疫分析，使用多功能酶標儀檢測450 nm波長的OD值，進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 股骨HE染色結(jié)果分析

空白組和假手術(shù)組骨膜完整，可見初級骨化中心與骨髓腔形成，許多初級骨髓腔融合成一個不斷增大并加長的骨髓腔；模型組骨髓腔較小，細胞種類少，骨小梁稀少且窄，小梁間距加大，顯示造模成功。壯骨止痛膠囊組和3-MA組，可見初級骨髓腔融合成一個不斷增大并加長的骨髓腔，有骨發(fā)生現(xiàn)象，RAPA組骨髓腔中細胞數(shù)量增多。見圖1。

圖1 壯骨止痛膠囊自噬作用對股骨的影響(200×)Fig.1 Effect of Zhuanggu Zhitong Capsule on femur(200×)注：A:空白組;B:假手術(shù)組;C:模型組;D:壯骨止痛膠囊組;E:RAPA組;F:3-MA組。

2.2 大鼠P2代BMMSCs生長曲線的繪制

與空白組相比，假手術(shù)組BMMSCs生長曲線差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組相比，壯骨止痛膠囊組、RAPA組和3-MA組細胞生長速率加快，有顯著差異(P<0.01)；與RAPA組相比，壯骨止痛膠囊組和3-MA組細胞生長速率加快，有差異(P<0.05)，壯骨止痛膠囊組和3-MA組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BMMSCs生長速率OD值變化Table 1 Changes in OD value of BMMSCs growth rate of rats in each group

2.3 大鼠P2代BMMSCs ALP活力的測定

與空白組相比，假手術(shù)組BMMSCs的ALP活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組ALP活力降低，且有顯著差異(P<0.01)，表明骨質(zhì)疏松可使大鼠BMMSCs的ALP活力顯著降低；與模型組相比，壯骨止痛膠囊組、RAPA組和3-MA組細胞ALP活力表達有顯著差異(P<0.01)，均呈現(xiàn)增高趨勢；與RAPA組相比，壯骨止痛膠囊組和3-MA組細胞ALP表達升高，結(jié)果有差異(P<0.05)，且壯骨止痛膠囊組和3-MA組細胞ALP表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠P2代BMMSCs的ALP活力Fig.2 ALP activity of P2 generation BMMSCs of rats in each group注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與RAPA組比較，*P<0.05。

2.4 大鼠股骨中Beclin1、LC3及p62蛋白的表達

與空白組比較，假手術(shù)組股骨Beclin1、LC3及p62蛋白平均灰度值表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組股骨Beclin1、LC3蛋白平均灰度值表達升高，p62蛋白平均灰度值表達降低，均有顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，壯骨止痛膠囊組和3-MA組Beclin1和LC3蛋白平均灰度值表達顯著降低(P<0.01)，RAPA組表達顯著升高(P<0.01)。壯骨止痛膠囊組和3-MA組p62蛋白平均灰度值表達顯著升高(P<0.01)，RAPA組表達顯著降低(P<0.01)；與RAPA組相比，壯骨止痛膠囊組和3-MA組Beclin1、LC3和p62蛋白表達均有顯著差異(P<0.01)，且壯骨止痛膠囊組和3-MA組股骨Beclin1、LC3及p62蛋白平均灰度值表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、4。

圖3 各組大鼠股骨Beclin1、LC3及p62蛋陽性表達(免疫組化染色，400×)Fig.3 Positive expression of Beclin1, LC3 and p62 eggs in the femur of rats in each group (immunohistochemical staining, 400×)

圖4 各組大鼠股骨Beclin1、LC3和p62蛋白平均灰度值表達Fig.4 The average gray value expression of Beclin1, LC3 and p62 protein in femur of rats in each group注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與RAPA組比較，**P<0.01。

2.5 大鼠血清PPAR-γ檢測

與空白組相比，假手術(shù)組血清PPAR-γ值表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組血清PPAR-γ值升高，且有顯著差異(P<0.01)，表明去卵巢大鼠能升高血清中PPAR-γ值；與模型組相比，壯骨止痛膠囊組、RAPA組和3-MA組血清PPAR-γ值均顯著降低(P<0.01)；與RAPA組相比，壯骨止痛膠囊組和3-MA組的血清PPAR-γ降低，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且壯骨止痛膠囊組和3-MA組的PPAR-γ值表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結(jié)果見圖5。

圖5 各組大鼠血清PPAR-γ含量Fig.5 Serum PPAR-γ content of rats in each group注：與假手術(shù)組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲▲P<0.01；與RAPA組比較，*P<0.05。

3 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥以腎精虧虛、骨枯髓減為本，以瘀血痹阻、骨絡失榮為標[11]。壯骨止痛膠囊具有補益肝腎、壯骨止痛之效，成為臨床治療骨質(zhì)疏松癥的良藥。本方中君藥補骨脂有溫腎壯陽之功，臣藥淫羊藿有強筋壯骨之效，此兩味藥能助生肝腎之陽。與之相輔的枸杞子、女貞子則能滋補肝腎之陰，方中骨碎補有活血通經(jīng)之用，使全方補而不滯，牛膝則為引經(jīng)藥，引藥下行達病所[12]?，F(xiàn)代研究[13]表明，自噬是機體防御機制的重要組成部分，在由雌激素缺乏引發(fā)的骨質(zhì)疏松中，其自噬水平產(chǎn)生變化，進而對BMMSCs的功能和活性產(chǎn)生一定的影響，進而參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。

通常WB、IHC、IF等方法檢測出的LC3的量可作為直接或者間接判定自噬是否激活的標志[15]。RAPA是與自噬激活相關(guān)的一種物質(zhì)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種在進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase)，它有2種復合物形式，其中mTORC1對RAPA敏感。在RAPA刺激下或營養(yǎng)不足時，mTORC1會與失調(diào)51樣激酶(uncoordinated-51-like-kinases，ULK)的復合物發(fā)生分離，促進ULK1/ULK2/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Atg13發(fā)生去磷酸化，介導自噬前體的形成、成核及延伸過程，即誘導自噬[16]。此外，Beclin 1、PI3KⅢ、3-MA 和p62蛋白對自噬也有影響。PI3KⅢ能與Beclin 1結(jié)合，形成Beclin 1-PI3KⅢ這種復合體，介導自噬前體和自噬體膜的形成，提高細胞的自噬水平。因此，Beclin 1和PI3KⅢ可以看做自噬的正向調(diào)控因子，3-MA則是通過抑制PI3KⅢ的活性抑制自噬[17-20]。p62蛋白是與自噬水平呈負相關(guān)的蛋白分子。當自噬激活時，p62蛋白與PE結(jié)合，定位于胞質(zhì)中，并與LC3-Ⅱ結(jié)合形成復合物被自噬溶酶體降解[21]，導致p62蛋白會在胞質(zhì)中被不停地降解，表達隨著下降。

BMMSCs是一種具有多向分化能力的干細胞，成脂或者成骨分化受到多種因素調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)[22-24]，壯骨止痛膠囊能調(diào)控Wnt/β-catenin和NF-κB信號通路，上調(diào)Wnt3a、β-catenin、LRP5蛋白的表達，下調(diào)GSK3β、NF-κB p65和IκBα蛋白表達，促進成骨，改善骨密度。壯骨止痛膠囊促成骨作用中涉及到的Wnt信號通路和Runx 2等轉(zhuǎn)錄因子的表達與BMMSCs有一定的關(guān)聯(lián)。研究認為[25-27]Wnt信號通路除了對成骨細胞有一定的調(diào)節(jié)作用外，其對BMMSCs分化方向的選擇具有決定性作用，BMMSCs既能成骨分化，也能成脂分化，且存在一定的動態(tài)性、連續(xù)性和階段性。Wnt信號通路激活后，在伴有Runx 2等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子高表達的情況下，能極大地促進成骨前體細胞及干細胞的骨向分化。此外，Wnt信號通路對成脂相關(guān)蛋白PPAR-γ也存在負向調(diào)控作用，且能顯性抑制成脂分化過程中細胞內(nèi)的生物學變化，從而抗成脂分化[28-29]，一般認為，PPAR-γ的高表達能正向調(diào)控脂肪分化的早期階段[30]。這個結(jié)論與本研究血清PPAR-γ的表達較一致，分析各組大鼠血清中的PPAR-γ水平發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛膠囊組和3-MA組的PPAR-γ水平表達降低，具有同步性。

ALP活力[31-35]是成骨細胞中期和晚期分化的標志，對BMMSCs的作用意味著其成骨化趨勢。在原代培養(yǎng)出的BMMSCs中，壯骨止痛膠囊組與3-MA組的BMMSCs的增殖和ALP活力變化具有趨同性，表明壯骨止痛膠囊組與3-MA組的實驗結(jié)果有較大相關(guān)性。研究表明[36-37]細胞自噬在BMMSCs的成脂分化過程中起到關(guān)鍵作用，但尚未有明確結(jié)論。本研究中，壯骨止痛膠囊組自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3和p62蛋白的表達與模型組呈現(xiàn)顯著差異，且壯骨止痛膠囊的作用與自噬抑制劑3-MA類似，可以推測壯骨止痛膠囊通過負向調(diào)控自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62、及LC3，抑制BMMSCs脂向分化，從而促進成骨。

綜上，壯骨止痛膠囊能降低血清中脂向表達分子PPAR-γ的表達，下調(diào)去卵巢大鼠股骨中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達，上調(diào)p62的表達，增加其BMMSCs細胞增殖活力和ALP活力，促進成骨。