劉飛祥 譚峰 樊巧玲 李星 葉素敏 張明玥 柴毅 麥聰英 吳丹

南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結(jié)合學院，江蘇 南京 210023

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的一類祖細胞，具有自我復制及向成骨細胞、成脂細胞、成軟骨細胞等方向分化的能力[1-2]。左歸丸(Zuoguiwan，ZGW)出自《景岳全書》，由鹿角膠、山藥、川牛膝、山茱萸、龜板膠、熟地、菟絲子和枸杞子八味藥物組成，具有滋陰補腎、填精益髓的作用[3]。研究表明[4-6]，ZGW含藥血清能夠通過調(diào)節(jié)骨保護蛋白/核因子κB受體激活因子配體/核因子κB受體活化因子等多條信號通路，促進BMSCs的增殖。在觀察ZGW含藥血清促進BMSCs增殖作用的實驗中，常需要用MTT法或CCK-8法對其進行增殖能力檢測。然而相關文獻報道的兩種方法，在檢測大鼠BMSCs增殖時的所采用的細胞接種密度差異較大，檢測波長不一，孵育時間不同，給實驗開展造成了一定困難[7-9]。鑒于此，筆者就兩種方法在檢測ZGW含藥血清干預BMSCs增殖時所需要的最佳實驗條件進行了比較，以期為相關人員提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：10只一周齡SPF級SD乳大鼠和20只8周齡SPF級SD大鼠均由南京市青龍山動物繁殖中心提供，合格證號為SCXK(SU)2017-0001，8周齡SPF級SD大鼠在南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心喂養(yǎng)。本次動物實驗研究獲得南京中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的同意(倫理號：201803A002)。

1.1.2儀器與試劑：MTT試劑盒(江蘇凱基)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學)，α-MEM(美國Gibco)，F(xiàn)BS胎牛血清(美國Gibco)，雙抗(美國Gibco)，二甲基亞楓(DMSO，美國Sigma)，酶聯(lián)免疫檢測儀(美國 PerkinElmer)。

1.2 方法

1.2.1ZGW凍干粉的制作：熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、川牛膝、菟絲子、龜甲膠和鹿角膠購買于南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。ZGW凍干粉的制作，即中藥(龜甲膠和鹿角膠除外)粉碎后分別煎煮2 h，然后過濾濃縮，洋化龜甲膠和鹿角膠，上Freeze Dryers凍干機-50 ℃干燥48 h，低溫干燥保存。

1.2.2含藥血清的制備：20只8周齡SPF級SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后分別給予ZGW(4.6 g/kg凍干粉)連續(xù)灌胃7 d。末次給藥2 h后，經(jīng)腹主動脈取血，以3 000 r/min，離心 15 min，然后血清過濾除菌、滅活，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?.5% ZGW含藥血清的配制：2.5 mL ZGW大鼠血清，86.5 mL α-MEM培養(yǎng)液，10 mL FBS，1 mL青鏈霉素。

1.2.3BMSCs的提取：乳大鼠頸椎脫臼法處死，取脛骨和股骨，暴露骨髓腔，斷端朝下放入無菌 EP管中，12 000 r/min離心30 s；離心管中加入10% α-MEM培養(yǎng)液，200 μm濾網(wǎng)過濾；然后紅細胞裂解液冰上裂解10 min；10% α-MEM培養(yǎng)液洗滌2次；然后接種于6孔板中，并在6 h、24 h后進行換液，之后每2～3 d更換新鮮的培養(yǎng)液，此時標記為P0。P0細胞在12 d后即融合至80%～90%，可進行傳代。

1.2.4波長檢測：按照1×104/孔的密度將P3細胞分別接種于2個96孔板中(MTT板，CCK-8板)，設置實驗組4個復孔，4個不含細胞的空白對照孔，ZGW含藥血清培養(yǎng)48 h后，MTT板加100 μL/孔MTT液，37 ℃孵育4 h，CCK-8板加20 μL/孔CCK-8液，37 ℃孵育3 h。檢測前，MTT板吸去上液，加DMSO 150 μL/孔，37 ℃恒溫震蕩10 min，以充分溶解甲臢?？字屑尤氲腗TT液和CCK-8液的量是根據(jù)各說明書中試劑與孔中培養(yǎng)液體積的比值進行計算。兩組送酶聯(lián)免疫檢測儀以410、430、450、470、490、510、530、550、570、590 nm的波長檢測。

1.2.5靈敏度檢測：按照每孔8×104、4×104、2×104、1×104、0.5×104、0.25×104、0.1×104、0的濃度將P3細胞分別接種在MTT板、CCK-8板中(96孔板)，每組設5個復孔。ZGW含藥血清培養(yǎng)48 h后，MTT組加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，測定前吸去培養(yǎng)液，每孔加150 μL DMSO，37 ℃恒溫震蕩10 min；CCK-8組每孔加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育3 h后送酶聯(lián)免疫檢測儀，波長分別為550 nm(MTT法)、450 nm(CCK-8法)。將每個細胞密度下所得的OD與其前一個密度條件下所得OD值相比，對所得的比值進行統(tǒng)計分析，從而觀察在細胞密度翻倍的情況下，兩種方法的靈敏度情況。

1.2.6孵育時間：按照每孔1×104、0.5×104、0.25×104、0的細胞密度將P3細胞接種于6個96孔板中，每組設置8個復孔，ZGW含藥血清培養(yǎng)48 h后，分別加入MTT和CCK-8試劑，在孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、10 h時進行檢測，同一細胞濃度每次檢測4個復孔，波長分別為550 nm(MTT試劑)、450 nm(CCK-8試劑)。

1.2.7生長曲線：取指數(shù)生長期的P3細胞，按照每孔0.05×104、0.1×104、0.25×104、0.5×104、1×104的細胞密度接種于8塊96孔板中，每組設4個復孔，在ZGW含藥血清干預1、2、3、5、7、9、11、13 d后，分別加入MTT和CCK-8試劑，孵育4 h和3 h后，以相應的波長進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 最佳波長

在細胞密度同為1×104/孔時，MTT法檢測的OD值在550 nm達到峰值，并從550 nm處其OD值向兩側(cè)逐漸遞減；CCK-8法檢測的OD值在450 nm達到峰值，并從450 nm處其OD值向兩側(cè)逐漸遞減(圖1)。

2.2 靈敏度檢測

在特定波長條件下，與CCK-8法相比較，在細胞密度為0.1×104/孔、2×104/孔、4×104/孔和8×104/孔時，MTT法對細胞在翻倍時OD值增加的響應量無明顯變化，差異統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與CCK-8法相比較，在細胞密度為0.25×104/孔、0.5×104/孔和1×104/孔時，MTT法對細胞在翻倍時OD值增加的響應量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2，表1)。

圖2 不同細胞密度下兩種試劑所檢測的OD值Fig.2 OD values of CCK-8 and MTT assay under different cell density

表1 不同細胞密度下兩種試劑的靈敏度Table 1 Sensitivity of CCK-8 and MTT assay under different cell density

2.3 孵育時間

在細胞密度為0.25×104/孔、0.5×104/孔和1×104/孔時，CCK-8法與MTT法檢測的OD值均與孵育時間呈正比。在細胞濃度為1×104/孔時，CCK-8法所測的OD值即將超過標曲，而在孵育時間超過10 h后，不同細胞密度下所得的OD值也超過標曲(圖3A)，這說明CCK-8法試劑孵育時，細胞密度應不超過1×104/孔，同時孵育時間應控制在一定范圍內(nèi)。而MTT法在檢測10 h后，檢測的OD值趨勢持續(xù)上升(圖3B)。

圖3 CCK-8法(A)與MTT法(B)的孵育時間Fig.3 Incubation time of CCK-8 (A) and MTT (B) assay

2.4 增殖曲線

采用CCK-8法檢測，在增殖的前7 d，BMSCs密度為0.05×104/孔和1×104/孔條件時，ZGW含藥血清干預后細胞的增長趨勢較慢，OD值幅度變化較?。欢毎芏葹?.25×104/孔和0.5×104/孔條件時，ZGW含藥血清干預后細胞的增長趨勢較快，OD值幅度變化較大，在第7天OD值達酶標儀上線，提前進入平臺期；而細胞密度為0.1×104/孔時，經(jīng)含藥血清干預后的BMSCs在前5 d緩慢增殖，從第7天開始呈對數(shù)生長，第11天時進入平臺期，生長曲線呈S形(圖4A)。

圖4 CCK-8法(A)和MTT法(B)檢測BMSCs的增殖實驗Fig.4 Proliferation of BMSCs detected by using CCK-8 (A) and MTT (B) assay

采用MTT法檢測，BMSCs密度為0.05×104/孔條件時，經(jīng)ZGW含藥血清干預后的BMSCs在整個觀察期內(nèi)增殖速度非常緩慢，至觀察末期未進入增長平臺期；在細胞密度為0.1×104/孔條件下，雖然在第5天開始，細胞成快速增長，但細胞生長第13天后尚未進入平臺；BMSCs密度為0.5×104/孔和1×104/孔條件時，BMSCs增殖速度快，增長幅度較大，在第7天進入平臺期，生長曲線呈S形；BMSCs密度為0.25×104/孔時，細胞傳代后第1～3天，吸光度變化不大，在第4～11天增勢明顯，在第11～13天進入平臺期，生長曲線呈S形(圖4B)。

3 討論

BMSCs主要存在于骨髓中，決定骨的生長發(fā)育和代謝。課題組前期關注左歸丸對BMSCs的增殖和分化研究[10-11]，然而在對BMSCs增殖實驗中，發(fā)現(xiàn)文獻報道中CCK-8與MTT對細胞接種的密度、孵育時間、靈敏度存在一定爭議，不利于實驗的開展。因此開展本次研究，以期為相關人員提供一定的參考。

CCK-8試劑生成的甲臢物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量呈正比[12]。該試劑無細胞毒性，隨著孵育時間的增加，細胞中的酶不斷產(chǎn)出甲臢物，OD值也會不斷增大，直至達到酶標儀檢測的上限。若檢測間隔時間較長，則所得OD值前后誤差較大，影響實驗準確性。MTT法的晶體生成量與活細胞數(shù)量和細胞活化狀態(tài)呈線性關系[13]。MTT法在孵育結(jié)束后，需要加入DMSO溶解沉積在細胞中的甲臢晶體。由于MTT試劑有細胞毒性，因此新生結(jié)晶較少，且溶解甲臢的速度較慢，所以其OD值在一定時間內(nèi)幅度增加有限，對實驗結(jié)果影響較小。

在特定波長下測定的甲臢物和甲臢晶體有其特定的波長，在此波長條件下，甲臢物和甲臢晶體能吸收做多的光能量[14]。本研究中CCK-8法與MTT法在檢測左歸丸含藥血清干預BMSCs增殖時，其OD值趨勢分別是從450 nm和550 nm處向兩側(cè)遞減。因而，可以確定550 nm和450 nm分別是MTT法與CCK-8法在檢測BMSCs增殖時的最佳測量波長。

靈敏度是反映一種方法對單位濃度或單位量待測物質(zhì)變化所致的響應量變化程度[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，當細胞密度過低(≤0.1×104/孔)或細胞密度過高(>1×104/孔)時，CCK-8法和MTT法對細胞在翻倍時OD值的變化均不敏感，響應量變化較小。當細胞密度范圍在0.1×104/孔至1×104/孔時，MTT法對細胞密度在翻倍時的響應量較大，靈敏度較高，而CCK-8法對細胞密度在翻倍時的響應量較小，靈敏度相對較差，二者具有明顯差異。因此以往通過OD值的大小來判斷CCK-8 法比 MTT 法對細胞濃度變化更加靈敏的說法有待商榷[16]。

BMSCs細胞體積較大，由于96孔板孔面積有限，且增殖實驗時間干預跨度較長，而細胞鋪滿96孔板需要7 d以上，細胞密度過高會造成細胞提前進入平臺期而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，密度過低會導致孵育時間過長而進入平臺期的時間延長，所以細胞的接種密度對于正確反映細胞的生長趨勢尤為關鍵[17]。本研究認為，當BMSCs接種密度分別高于0.25×104/孔和0.5×104/孔時，所測OD值因超酶標儀上限，兩種試劑均提前出現(xiàn)假S型曲線。當BMSCs接種密度0.1×104/孔時，由于細胞前期生長緩慢，后期持續(xù)生長，進入平臺期延遲，也不能正確反映出細胞的生長趨勢。因此，使用CCK-8和MTT試劑時，只有當細胞接種密度分別控制在0.1×104/孔至0.25×104/孔之間和0.25×104/孔左右時，才能較好地反映出左歸丸含藥血清干預BMSCs的增殖趨勢。

綜上所述，在研究左歸丸含藥血清干預BMSCs增殖實驗中，使用CCK-8試劑時，檢測波長為450 nm，孵育時間為3 h，細胞接種密度為0.1×104/孔；使用MTT試劑檢測時，波長為550 nm，孵育時間為4 h，細胞接種密度以0.25×104/孔為最佳。MTT法對細胞密度在0.1×104/孔至1×104/孔時翻倍的響應量較大，靈敏度較高，優(yōu)于CCK-8法。