李 潔,杜金穗,唐品清,吳冬雪,董辰辰

(1. 東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009；2. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

膿毒癥是由感染誘發(fā)的機(jī)體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，通過(guò)激活免疫系統(tǒng)釋放多種炎癥因子，免疫失衡的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致全身多系統(tǒng)、多器官功能障礙，是臨床重癥監(jiān)護(hù)病房危重患者的死亡常見(jiàn)原因[1]。膿毒癥導(dǎo)致的心肌損傷累及心臟收縮和舒張功能，一旦并發(fā)休克出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)異常，通常預(yù)后較差，故早期干預(yù)膿毒癥心肌損傷具有重要的臨床意義[2]。膿毒癥心肌損傷的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、一氧化氮及能量代謝失衡等因素密切相關(guān)。線粒體是合成三磷酸腺苷(ATP)的主要細(xì)胞器，其還參與鈣儲(chǔ)備調(diào)控、細(xì)胞信息傳遞以及細(xì)胞凋亡調(diào)控，對(duì)各種損傷極為敏感，是防治膿毒癥心肌損傷的主要干預(yù)靶點(diǎn)。膿毒癥發(fā)生時(shí)，活性氮和氧自由基的生成增加，線粒體內(nèi)外鈣穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體嵴被破壞，引起線粒體發(fā)生腫脹、碎裂，損傷線粒體有氧呼吸功能，導(dǎo)致合成ATP功能障礙[3]。目前研究證實(shí)，中醫(yī)藥可從線粒體能量代謝、線粒體融合與分裂、線粒體氧化應(yīng)激等多個(gè)方面調(diào)控機(jī)體五臟陰陽(yáng)平衡，闡明了中醫(yī)藥以細(xì)胞線粒體為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)“氣”的作用機(jī)制[4]。膿毒癥心肌損傷以正虛毒損、絡(luò)脈瘀滯為主要病機(jī)，中醫(yī)藥能通過(guò)清熱解毒、扶正固本、活血化瘀等調(diào)節(jié)機(jī)體的氣血陰陽(yáng)平衡，進(jìn)而防治膿毒癥心肌損傷[5]。心脈隆注射液以美洲大蠊成蟲(chóng)為原料提取、精制而成，其可以通過(guò)激活P13/Akt通路、抑制Erk1/2-P38MAPK信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞自噬，減輕抗腫瘤藥物表柔比星對(duì)心臟的毒性作用[6]，但其對(duì)于膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。本研究采用具有抗原性的脂多糖(LPS)建立膿毒癥小鼠模型，探討了心脈隆注射液對(duì)膿毒癥心肌保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠30只，體重(25±2)g，由東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(蘇)2016-0014。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度(23±2)℃、濕度40%～70%的動(dòng)物房，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

1.2藥物和試劑 心脈隆注射液(云南騰藥制藥股份有限公司，批號(hào)：1712101，規(guī)格：2 mL/100 mg)；LPS(血清型O111:B4，Sigma-Aldrich公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活力檢測(cè)試劑盒以及丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物科技公司；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC-1α)抗體、解耦聯(lián)蛋白2(UCP2)抗體購(gòu)自武漢賽維爾生物有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 將小鼠隨機(jī)分為3組：空白組和膿毒癥組連續(xù)3 d腹腔注射生理鹽水，心脈隆注射液組連續(xù)3 d腹腔注射心脈隆注射液200 mg/(kg·d)，膿毒癥組和心脈隆注射液組第3天同時(shí)腹腔注射LPS 10 mg/kg。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1心肌酶及氧化應(yīng)激指標(biāo) LPS注射8 h后，采用20%烏拉坦(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉各組小鼠(包括空白組小鼠)，開(kāi)胸心臟取血5 mL，置不加抗凝劑的試管內(nèi)，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清乳酸脫氫酶-1(LDH-1)及肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)水平，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)活力，應(yīng)用分光光度法檢測(cè)血清丙二醛(MDA)水平。

1.4.2心肌組織病理表現(xiàn) 取血后，迅速分離心肌組織，新鮮組織用固定液固定24 h，脫水浸蠟，將浸蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，于-20 ℃凍臺(tái)冷卻，將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片，厚4 μm。切片漂浮于攤片機(jī)40 ℃溫水上將組織展平，載玻片將組織撈起，60 ℃烘箱內(nèi)烤片，取出常溫保存,HE染色后進(jìn)行鏡下觀察。

1.4.3心肌組織中TNF-α含量 稱取心肌組織，按重量與體積1∶9 的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下制成 10%的勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出TNF-α含量。

1.4.4心肌組織中 PGC-1α、UCP2蛋白表達(dá)情況采用Western blot法檢測(cè)：心肌組織塊用預(yù)冷的PBS洗滌2～3次，剪成小塊置于勻漿管中，采用BCA法對(duì)心肌組織進(jìn)行蛋白定量。將蛋白溶液按照4∶1的比例加入上樣緩沖液，沸水浴變性15 min后-20 ℃冰箱保存。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)印完的膜放入裝有TBST緩沖液的孵育槽中，室溫下封閉30 min。倒掉孵育槽中的封閉液，加入配置好的一抗GAPDH(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、UCP2(1∶2 00)，4 ℃孵育搖床過(guò)夜；回收一抗，洗膜，然后加入TBST緩沖液，放置脫色搖床上快速洗脫，每次5 min，洗3次；將二抗用TBST緩沖液按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋，室溫下孵育30 min；用TBST緩沖液快速涮洗膜3次，然后再加入TBST緩沖液，放置脫色搖床上快速洗脫，每次5 min，洗3次。 在暗室中將PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣兩層薄膜之間，加入混合好的ECL溶液充分反應(yīng)，1～2 min后，去盡殘液，蓋上層薄膜開(kāi)始?jí)耗z片。壓完的膠片用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清LDH-1、CK-MB水平比較 膿毒癥組小鼠血清LDH-1、CK-MB水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，心脈隆注射液組小鼠血清LDH-1、CK-MB水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和膿毒癥各組小鼠血清LDH-1、CK-MB水平比較

2.2各組小鼠血清SOD、MDA水平比較 與空白組比較，膿毒癥組小鼠血清SOD水平明顯降低(P<0.05)，血清MDA水平明顯增高(P<0.05)；與膿毒癥組比較，心脈隆注射液組小鼠血清SOD水平明顯增高(P<0.05)，血清MDA水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和膿毒癥各組小鼠血清SOD、MDA水平比較

2.3各組小鼠心肌組織病理形態(tài) HE染色顯示，空白組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)及排列正常，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙無(wú)異常改變；膿毒癥組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與膿毒癥組比較，心脈隆注射液組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂減輕，心肌組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。見(jiàn)圖1。

圖1 空白組和膿毒癥各組小鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組小鼠心肌組織中TNF-α含量比較 空白組、膿毒癥組、心脈隆注射液組TNF-α含量分別為(71.69±10.95)pg/mL、(283.23±58.07)pg/mL、(157.82±29.06)pg/mL，膿毒癥組明顯高于空白組(P<0.05)，心脈隆注射液組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.5各組小鼠心肌線粒體中PGC-1α、UCP2蛋白表達(dá)情況比較 膿毒癥組小鼠心肌線粒體中PGC-1α、UCP2蛋白表達(dá)量均明顯低于空白組(P均<0.05)，心脈隆注射液組均明顯高于膿毒癥組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 空白組和膿毒癥各組小鼠心肌線粒體中PGC-1α和UCP2蛋白表達(dá)情況

3 討 論

心脈隆注射液具有益腎、利尿消腫、改善循環(huán)等作用，可保護(hù)膿毒癥患者的腸黏膜屏障，緩解臨床癥狀，改善患者預(yù)后[7]。近年心脈隆注射液用于心力衰竭的研究顯示，其不僅可以緩解慢性充血性心力衰竭患者氣陽(yáng)兩虛、瘀血內(nèi)阻等相關(guān)癥狀[8]，還可以調(diào)控心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)，改善肌漿網(wǎng)對(duì)鈣離子的調(diào)節(jié)作用，緩解線粒體內(nèi)外的鈣穩(wěn)態(tài)失衡，維持重癥心力衰竭患者的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定[9]。本課題組前期研究結(jié)果表明，美洲大蠊提取物可通過(guò)pink1/parkin信號(hào)通路調(diào)控自噬相關(guān)蛋白線粒體融合蛋白1(MFN1)、線粒體融合蛋白2 (MFN2)、OPA1、Drp1的表達(dá)，拮抗LPS誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡[10]；還可以通過(guò)AMPK/PGC-1α信號(hào)途徑抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)過(guò)程，維持肝細(xì)胞線粒體膜電位平衡，有效拮抗LPS誘導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷[11]，但心脈隆注射液對(duì)膿毒癥心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制仍不十分明確。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是膿毒癥發(fā)病進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)。膿毒癥時(shí)釋放的炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可以通過(guò)c-Scr /脫乙?；?3通路介導(dǎo)炎癥因子TNF-α的表達(dá)，誘導(dǎo)mtDNA出現(xiàn)氧化損傷，影響線粒體氧化磷酸化效應(yīng)，加速心肌線粒體DNA損傷和能量合成障礙，影響心臟收縮和舒張功能，導(dǎo)致膿毒癥患者血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定；另外氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致線粒體動(dòng)力平衡失調(diào)，伴線粒體膜內(nèi)膜和外膜結(jié)構(gòu)的損傷，誘發(fā)組織器官損傷[12-13]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，LPS誘導(dǎo)膿毒癥大鼠體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量氧自由基，引起心肌氧化損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射LPS制備膿毒癥心肌損傷模型，結(jié)果顯示膿毒癥組小鼠血清LDH-1、CK-MB、MDA水平及心肌組織中TNF-α含量明顯升高，SOD水平明顯降低，病理觀察顯示心肌組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示膿毒癥小鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致心肌損傷；心脈隆注射液組小鼠血清LDH-1、CK-MB、MDA水平及心肌組織中TNF-α含量均明顯低于膿毒癥組，SOD水平明顯高于膿毒癥組，表明心脈隆注射液能抑制心肌炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)膿毒癥誘發(fā)的心肌損傷具有保護(hù)作用。

有研究表明，PGC-1α參與調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量控制和能量代謝，PGC-1α與線粒體內(nèi)膜上UCP2相結(jié)合可以介導(dǎo)UCP2的表達(dá)；UCP2的過(guò)表達(dá)能抑制氧自由基產(chǎn)生，調(diào)控線粒體的鈣攝取，緩解炎癥導(dǎo)致的心肌線粒體損傷[15-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 膿毒癥組小鼠心肌線粒體中PGC-1α、UCP2蛋白表達(dá)量均低于空白組，心脈隆注射液組均高于膿毒癥組，提示心脈隆注射液可能通過(guò)激活PGC-1α/UCP2通路抑制膿毒癥小鼠心肌氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)。

綜上所述，美洲大蠊提取物心脈隆注射液對(duì)膿毒癥小鼠的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制PGC-1α/UCP2介導(dǎo)的心肌炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，為探討中西醫(yī)結(jié)合防治膿毒血癥心肌損傷提供了新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。