周靜珠，程宏亮，陳 歡，徐萬里，朱偉堅，周 帥，張朝暉

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

慢性內(nèi)臟痛是功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)患者最常見的癥狀之一，其中內(nèi)臟高敏是FD慢性內(nèi)臟痛關(guān)鍵機(jī)制之一[1-3]。神經(jīng)生長因子(NGF)在啟動以及長期加劇炎癥反應(yīng)的疼痛敏感性中起著關(guān)鍵作用，其能引起傳入神經(jīng)敏化，從而引起內(nèi)臟高敏[4]。相關(guān)實驗研究發(fā)現(xiàn)，幼年大鼠的腸道輕度炎癥刺激可引起成年后出現(xiàn)自主神經(jīng)功能紊亂，交感神經(jīng)活性增加而迷走神經(jīng)低張，血漿去甲腎上腺素(NE)水平升高，胃底部肌層NGF表達(dá)上調(diào)，繼而出現(xiàn)內(nèi)臟高敏[5]。在FD患者中也檢測到胃底部NGF mRNA表達(dá)升高[6]。目前內(nèi)臟痛的治療手段非常有限且效果不佳，長期服用鎮(zhèn)痛藥物易出現(xiàn)成癮性，并可能出現(xiàn)繼發(fā)性消化道損傷。耳穴療法是祖國傳統(tǒng)外治療法，廣泛運用臨床各科疾病?；诙溪毺氐捏w表迷走神經(jīng)耳支分布，耳穴療法可以通過刺激耳迷走神經(jīng)來調(diào)控內(nèi)臟感覺、運動[7-8]。耳迷走神經(jīng)主要分布在耳郭的耳甲區(qū)，本課題組前期研究顯示單次耳電針耳甲區(qū)“胃”穴可以有效緩解FD大鼠內(nèi)臟高敏，且此效應(yīng)與調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)功能密切相關(guān)[9]。本研究通過建立幼鼠三硝基苯磺酸灌腸誘導(dǎo)FD胃部高敏模型，觀察肌電圖、動物行為學(xué)、血漿NE、胃底NGF mRNA和蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步研究了耳電針的效應(yīng)規(guī)律及機(jī)制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 購入SPF級別孕鼠[遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCKX(遼)2020-0001]，選取新生雄性大鼠進(jìn)入實驗。實驗動物飼養(yǎng)條件為室溫22～24 ℃，濕度50%，光照周期12 h/12 h，母鼠自由進(jìn)食，幼鼠與母鼠同籠飼養(yǎng)。本研究獲得《南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會》審查同意(IACUC-2004001)。

1.2主要試劑及儀器 華佗牌一次性無菌針灸針(0.25 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，中國)，電針儀(CMNS6-2型，無錫佳鍵，中國)；肌電圖電極線(A&E Medical,Farmingdale,NJ,美國)；肌電圖放大器(EMG 100C;Biopac systems,Inc,Santa Barbara,CA,美國)；大鼠NE酶聯(lián)免疫分析試劑盒(MM-20302R1，酶免，中國)；酶標(biāo)儀(Multiskan FC，Thermo，美國)；低溫離心機(jī)(D3024R，SCILOGEX，美國)；Real time PCR儀(TL998-IV，天隆科技，中國)；梯度PCR儀(TC1000-G，SCILOGEX，美國)；DYCZ-24DN型垂直電泳裝置(北京市六一儀器廠，中國)；RIPA裂解液，BCA試劑盒、GAPDH polyclonal antibody、NGF Rabbit pAb(南京恩晶生物，中國)。

1.3實驗方法 按照實驗?zāi)康?，為了減少實驗操作對觀察指標(biāo)的影響，分為2部分實驗。

1.3.1實驗一 將16只10 d齡雄性幼鼠隨機(jī)分為對照組和耳電針組，每組8只。耳電針組幼鼠參照文獻(xiàn)[4]制備FD胃部高敏模型：用1 mL注射器抽取配置好的三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌腸溶液(用量為130 mg/kg，溶解入含10%乙醇的生理鹽水0.2 mL中)，然后將1 mL注射器連接2 cm的細(xì)軟管插入幼鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸灌腸，灌腸后保持頭朝下位置2 min，以防止液體流出。對照組幼鼠灌入等量生理鹽水。造模后，所有幼鼠與母鼠繼續(xù)共同飼養(yǎng)。2組大鼠第7周齡時，埋置胃部氣囊(腹腔注射2%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后進(jìn)行腹部剃毛，用外科刀片做前正中切口，打開腹腔，找到胃底，做荷包縫合，用眼科剪剪開小口，插入氣囊，連接氣囊的PE管從肌肉層穿出到皮下走行至頸部出)和頸部肌電圖檢測電極(于大鼠頸部一側(cè)肩峰下斜方肌埋置一對肌電圖電極，電極線留在頸部與PE管一起穿出)，恢復(fù)1周后，第8周齡進(jìn)入實驗。對照組大鼠不做特殊處理；耳電針組大鼠接受電針耳穴刺激：采用2.0%～2.5%異氟烷吸入麻醉后，將大鼠放入特定裝置固定，麻醉清醒后開始電針治療。參照人體耳穴分布，選用雙側(cè)耳穴“胃”穴(參照人體的耳穴“胃”，屬于耳迷走神經(jīng)分布區(qū))[9-10]。針刺后連接電針，電針參數(shù)：2 Hz，連續(xù)波，1.0～1.5 mA(以大鼠耳部微微顫動為度)。每次治療30 min，每日1次，連續(xù)5次。

1.3.2實驗二 將40只10 d齡雄性幼鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、耳電針組、電針對照組，每組10只。除對照組外，其余組幼鼠均按照實驗一中方法建立FD胃部高敏模型。各組大鼠第8周齡進(jìn)入實驗，耳電針組按照實驗一中方法進(jìn)行電針，電針對照組選取雙側(cè)大鼠耳垂進(jìn)行電針(其余操作同耳電針組)，每次治療30 min，每日1次，連續(xù)5次。對照組和模型組大鼠不做針刺干預(yù)，每日抓取固定于特殊裝置內(nèi)，連續(xù)5 d。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1實驗一 分別記錄2組大鼠第8周齡時(電針干預(yù)前)頸部斜方肌肌電積分、腹部回撤反射評分和耳電針組單次耳電針后(即時效應(yīng))、5次耳電針后(累加效應(yīng))及耳電針結(jié)束后第3，5，10天(維持效應(yīng))頸部斜方肌肌電積分。①肌電檢測方法：將肌電圖電極連接肌電圖記錄儀，用三通管分別連接胃部氣囊的PE管、血壓計和血壓計氣囊，測定在不同壓力下(20，40，60，80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)肌電圖的數(shù)值，通過肌電分析軟件自動對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波降噪處理，數(shù)據(jù)歸一化與統(tǒng)計分析。②腹部回撤反射評分方法及標(biāo)準(zhǔn)：將大鼠放于特定的透明固定器，使之能自由活動而便于觀察。給予大鼠胃部氣囊充氣后進(jìn)行不同壓力(20，40，60，80 mmHg)刺激，引起大鼠的疼痛。0分：對胃部擴(kuò)張無反應(yīng)；1分：有動作停頓后出現(xiàn)短暫的頭部運動行為；2分：可見腹部肌肉收縮；3分：有腹部抬起行為；4分：身體拱起，并抬起盆腔和陰囊[11]。

1.4.2實驗二

1.4.2.1胃壁和腸壁病理形態(tài) 各組大鼠在相應(yīng)處理5 d結(jié)束后，給予巴比妥鈉100 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速開腹，取胃底部和遠(yuǎn)端結(jié)腸，用10%福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胃壁和腸壁有無結(jié)構(gòu)改變。

1.4.2.2血漿NE水平 心臟取血，按照ELISA說明書檢測血漿NE水平。

1.4.2.3胃底組織中NGF mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測：TRIzol試劑盒提取胃底組織內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列：β-actin上游5’-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3’，下游5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’；NGF上游5’-CCAGAGGCGGGGTTTCAT-3’，NGF下游5’-TGAGACACTCGCTCAGCTTC-3’。反應(yīng)體系：2×qPCR MasterMix 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.6 μL，Reverse Primer 0.6 μL，模板1 μL，Nuclease-FreeWater 7.8 μL。反應(yīng)條件：95.0 ℃ 10 min；95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 30 s，40個周期；熔解曲線：60～95.0 ℃，0.5 ℃，5 s/次。按照2-△△Ct相對定量計算公式計算目的基因相對表達(dá)量。

1.4.2.4胃底組織中NGF蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測：取-80 ℃冰凍的胃底組織，勻漿、裂解、離心后取上清液，采用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度，配制SDS變性聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合后，煮沸變性5 min，冰浴5 min。上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃ 350 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，將膜置于1×孵育封閉液中，室溫?fù)u動封閉2 h，加一抗孵育封閉液中，4 ℃搖動過夜。洗膜4次，加二抗孵育封閉液中，室溫作用1.5 h，洗膜4次后顯影機(jī)中顯影。使用Image J測量灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1實驗一中2組大鼠肌電積分和腹部回撤反射評分比較 胃部球囊擴(kuò)張壓力為40，60和80 mmHg時，耳電針組大鼠第8周齡電針前的肌電積分均明顯高于對照組(P均<0.05)；胃部球囊擴(kuò)張壓力為60和80 mmHg時，耳電針組大鼠第8周齡電針前的腹部回撤反射評分均明顯高于對照組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 不同胃部球囊擴(kuò)張壓力下2組大鼠第8周齡時肌電積分和腹部回撤反射評分

2.2實驗一中耳電針組大鼠不同時間點肌電積分比較 胃部球囊壓力為20和40 mmHg時，單次耳電針后、5次耳電針后、耳電針結(jié)束后第3，5，10天的肌電積分與第8周齡電針前的肌電積分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。胃部球囊擴(kuò)張壓力為60和80 mmHg時，單次耳電針后的肌電積分均明顯低于第8周齡電針前(P均<0.05)；5次耳電針后的肌電積分均明顯低于單次耳電針后(P均<0.05)；耳電針結(jié)束后第3天的肌電積分與5次耳電針后比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；耳電針結(jié)束后第5天的肌電積分均明顯高于5次耳電針后(P均<0.05)，仍明顯低于第8周齡電針前(P均<0.05)；耳電針結(jié)束后第10天的肌電積分均明顯高于5次耳電針后(P均<0.05)，與第8周齡電針前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 不同胃部球囊擴(kuò)張壓力下耳電針組大鼠不同時間點肌電積分

2.3實驗二中各組大鼠胃底、遠(yuǎn)端結(jié)腸HE染色形態(tài) 胃底HE染色顯示：對照組大鼠胃底部黏膜層被覆單層柱狀上皮，排列整齊，固有層內(nèi)有胃腺，胃腺頸部可見少量黏液細(xì)胞，各部位未見明顯病變；各造模組大鼠胃壁組織結(jié)構(gòu)同對照組，黏膜層上皮細(xì)胞無變性壞死，胃腺頸部黏液細(xì)胞數(shù)量輕度增多，固有層無增多的炎細(xì)胞，黏膜下層無充血、水腫，無炎細(xì)胞浸潤，肌層細(xì)胞無變性壞死，見圖3。遠(yuǎn)端結(jié)腸HE染色顯示：對照組和各造模組大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞無變性、壞死，黏膜固有層和黏膜下層無充血、水腫，無炎細(xì)胞浸潤，肌層、漿膜層無炎細(xì)胞浸潤或其他病變。見圖4。

圖3 對照組和胃部高敏各組大鼠胃底組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

圖4 對照組和胃部高敏各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.4實驗二中各組大鼠血漿NE水平比較 模型組和電針對照組大鼠血漿NE水平均明顯高于對照組(P均<0.05)，耳電針組大鼠血漿NE水平均明顯低于模型組與電針對照組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 對照組和胃部高敏各組大鼠血漿NE水平

2.5實驗二中各組大鼠胃底組織中NGF mRNA及蛋白表達(dá)情況比較 模型組和電針對照組大鼠胃底組織中NGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量均明顯高于對照組(P均<0.05)，耳電針組大鼠胃底組織中NGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組和電針對照組(P均<0.05)。見圖6及圖7。

圖6 對照組和胃部高敏各組大鼠胃底組織中NGF mRNA相對表達(dá)量

圖7 對照組和胃部高敏各組大鼠胃底組織中NGF蛋白表達(dá)情況

3 討 論

《靈樞·口問》中記載：“耳者，宗脈之所聚也?！倍c諸多經(jīng)絡(luò)有連屬關(guān)系，刺激耳穴可調(diào)和陰陽和臟腑功能。諸多研究表明，耳郭上分布著人體唯一的體表迷走神經(jīng)，刺激耳迷走神經(jīng)分布區(qū)可以激活大腦相關(guān)通路，從而激活迷走神經(jīng)傳出支配內(nèi)臟的纖維，對內(nèi)臟功能起調(diào)節(jié)作用[7-8]。本課題組前期研究顯示，耳電針可通過改善迷走神經(jīng)活性，緩解FD內(nèi)臟高敏，即時效應(yīng)明顯[9]。

諸多研究表明，針灸鎮(zhèn)痛具有累加效應(yīng)和長時程維持效應(yīng)[10-11]。李為民等[12]采用電針“足三里”和“上巨虛”干預(yù)腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟痛，結(jié)果顯示單次電針5 min后即開始顯現(xiàn)鎮(zhèn)痛效應(yīng)，20～30 min后達(dá)到高峰，能維持20～90 min；且多次電針療效優(yōu)于單次電針，停止電針后鎮(zhèn)痛效應(yīng)仍可以維持一段時間。吳鎏楨等[13]研究表明，電針刺激對大鼠嗎啡戒斷癥狀的抑制作用有累加效應(yīng)，多次治療后抑制效應(yīng)可維持1周?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本實驗設(shè)計了耳電針的療效觀察時間點，采用較為成熟的FD內(nèi)臟高敏大鼠模型，進(jìn)一步觀察了耳電針的累加效應(yīng)和維持效應(yīng)。FD內(nèi)臟高敏模型的特點是在大鼠幼年時期給予遠(yuǎn)端結(jié)腸炎癥刺激，在大鼠成年后表現(xiàn)出功能上的內(nèi)臟高敏，而胃黏膜和結(jié)腸黏膜無明顯的炎癥反應(yīng)，這與臨床上FD的診斷相符合[14]。本實驗通過肌電檢測證實成功復(fù)制了非炎癥性的內(nèi)臟高敏模型，胃、結(jié)腸黏膜病理觀察證實幼年造模未對成年大鼠胃腸及遠(yuǎn)端結(jié)腸造成炎癥反應(yīng)。耳電針的效應(yīng)研究結(jié)果顯示，5次耳電針的累加鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯優(yōu)于單次的即時效應(yīng)，且電針結(jié)束后第3天鎮(zhèn)痛效應(yīng)仍維持較好；在電針結(jié)束后第5天效應(yīng)雖有減弱，但仍具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)；在電針結(jié)束后第10天效應(yīng)衰減，鎮(zhèn)痛效應(yīng)不明顯。提示給予FD大鼠耳電針，可有效緩解胃部高敏，即時效應(yīng)明顯，5次耳電針治療的累加效應(yīng)顯著，且有一定的維持效應(yīng)。

NGF具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學(xué)功能，是一種神經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。NGF對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用[15]，其與內(nèi)臟高敏關(guān)系密切[16-18]。相關(guān)研究顯示，內(nèi)臟痛大鼠外周組織中NGF表達(dá)升高[4，16，19]；大鼠新生期結(jié)腸刺激可導(dǎo)致成年后結(jié)腸組織中NGF表達(dá)升高，引起感覺神經(jīng)元電生理改變，致腸易激綜合征內(nèi)臟高敏感[20]；早期的母嬰分離可引起成年后腸神經(jīng)系統(tǒng)可塑性改變，通過阻斷NGF信號通路可部分緩解內(nèi)臟高敏[21]。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠血漿NE水平、胃底組織中NGF mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組，說明幼年時期的結(jié)腸炎癥刺激可導(dǎo)致成年后大鼠胃底組織中NGF表達(dá)增高，這可能與血漿NE水平升高有關(guān)。因為幼年時期的結(jié)腸炎癥刺激，可上調(diào)在腹腔神經(jīng)節(jié)的酪氨酸羥化酶水平，從而促進(jìn)胃底肌層外的NE釋放，NE增加會依賴性地上調(diào)NGF，NGF成比例地增加胃擴(kuò)張的內(nèi)臟運動反應(yīng)[19]。耳電針組大鼠血漿NE水平、胃底組織中NGF mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，說明耳電針可抑制NE釋放，下調(diào)NGF表達(dá)，這可能是耳電針緩解內(nèi)臟高敏的機(jī)制之一。

綜上所述，耳電針可緩解FD內(nèi)臟高敏，多次干預(yù)效果更顯著，且有一定的維持效應(yīng)，其緩解效應(yīng)可能與調(diào)控血漿NE和胃底組織NGF的表達(dá)有關(guān)。本實驗結(jié)果為耳穴療法調(diào)節(jié)功能性胃腸病提供了客觀依據(jù)，有利于耳穴療法在臨床中的推廣運用。但本實驗未觀察該療法對大鼠胃排空及其他相關(guān)癥狀的影響，機(jī)制研究比較局限，未進(jìn)行中樞機(jī)制及相關(guān)通路的探討，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。