何慧慧,劉衛(wèi)紅，賈 瑞,王 晶,林珊珊,馬寧怡,劉新光,李 亞1，

1)河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 鄭州 450099 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室中藥藥理(呼吸)實驗室 鄭州 450099

男性生育能力下降，已成為不可忽視的公共健康問題。影響男性生殖功能的因素較多，空氣污染、電離輻射、慢性炎癥、不良生活習(xí)慣等均有生殖毒性，可引起生殖器官及精子結(jié)構(gòu)損傷或功能障礙，最終導(dǎo)致不育。顆粒物(particulate matter,PM)2.5是指空氣動力學(xué)當(dāng)量直徑<2.5 μm的PM，作為影響大氣質(zhì)量的主要污染物，可隨呼吸運動進入人體，不僅導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)損傷，還可隨血液循環(huán)，對遠處臟器造成損害。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》“婦人妊娠病脈證并治第二十”，作為婦科疾病的常用方劑之一，為歷代醫(yī)家所推崇。近年來，在中醫(yī)異病同治的理論指導(dǎo)下，其應(yīng)用范圍逐漸擴大，不僅對于急慢性盆腔炎、妊娠病、月經(jīng)病等婦科病具有良好療效[1]，還對睪丸鞘膜積液、精索靜脈曲張、附睪炎等男科疾病也具有較好治療效果[2]。本研究探討了當(dāng)歸芍藥散對PM2.5暴露大鼠肺組織、睪丸組織及睪丸組織代謝物的影響,為防治PM2.5暴露導(dǎo)致的雄性生殖損傷的基礎(chǔ)研究及臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組及主要試劑、儀器SPF級雄性SD大鼠18只，6～8周齡，體重200～220 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[SCXK(魯)2014007]；適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分成對照組、PM2.5組、當(dāng)歸芍藥散組，每組6只。當(dāng)歸芍藥散顆粒劑(相當(dāng)于含生藥量：當(dāng)歸9 g、白芍48 g、川芎24 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉24 g)由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供，灌胃時采用蒸餾水配制為0.11 kg/L的溶液。PM2.5實時在線濃縮富集系統(tǒng)、動物全身動態(tài)暴露系統(tǒng)(北京慧榮和科技有限公司)。LEICA-DM6000B型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(萊卡，德國)，超快速液相色譜、四極桿軌道離子阱質(zhì)譜、真空離心濃縮儀、XCalibur質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集軟件(賽默飛,美國)，反向色譜柱、親水作用色譜柱(沃特世,英國)。

1.2 干預(yù)措施采用PM2.5實時在線濃縮富集系統(tǒng)對大氣中PM2.5進行分離、濃縮后輸入密封的動物全身動態(tài)暴露系統(tǒng)，采用PM2.5實時在線濃縮富集系統(tǒng)和DUST TRAKTM Ⅱ系統(tǒng)同步實時記錄暴露箱內(nèi)的PM2.5濃度、溫度、濕度。每天PM2.5組及當(dāng)歸芍藥散組大鼠暴露4 h，暴露濃度為573.61 μg/m3，持續(xù)12周。對照組無暴露期間動物飼養(yǎng)于獨立通風(fēng)籠具的過濾空氣環(huán)境中。自PM2.5暴露第9周起對照組和PM2.5組給予生理鹽水(2 mL/只)灌胃，當(dāng)歸芍藥散組給予2 g/(kg·d)當(dāng)歸芍藥散，1次/d灌胃。每周稱取大鼠體重以調(diào)整灌胃劑量，持續(xù)給藥4周。

1.3 肺組織病理學(xué)觀察給藥結(jié)束后處死大鼠，左肺經(jīng)氣管-支氣管插管，體積分數(shù)10%中性甲醛固定72 h，以肺門為中心，連續(xù)切取3 mm厚的組織塊，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 睪丸組織病理學(xué)觀察取左側(cè)睪丸，在改良的Davidson′s固定液中固定18～24 h，于體積分數(shù)10%甲醛溶液中繼續(xù)固定24 h。將睪丸從中部橫切，取4 mm厚的組織塊，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 睪丸組織代謝組學(xué)分析

1.5.1樣本處理 ①反相色譜分析樣本處理方法：稱取50 mg睪丸組織，研磨后加入300 μL甲醇和1 mL甲基叔丁基醚混勻振蕩1 h，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上層溶液300 μL揮干，100 μL甲醇復(fù)溶后置于200 μL內(nèi)襯管中，待測。②親水色譜分析樣本處理方法：稱取50 mg睪丸組織，研磨后加1 mL乙腈∶水體積比1∶1的溶液混勻振蕩30 min，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上層溶液100 μL，置于200 μL內(nèi)襯管中，待測。

1.5.2氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件 ①色譜條件。反相色譜分離條件：色譜柱，1.8 μm,2.1 mm×100 mm；流動相，A(乙腈∶水體積比4∶6，體積分數(shù)0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨)和B(乙腈∶異丙醇體積比9∶1，體積分數(shù)0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨)；按設(shè)置程序進行梯度洗脫，流速0.3 mL/min，進樣量為1 μL，柱溫50 ℃。親水色譜分離條件：色譜柱，1.7 μm,2.1 mm×100 mm；流動相，A(乙腈，體積分數(shù)0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨)和B(水，體積分數(shù)0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨)；按設(shè)置程序進行梯度洗脫，流速0.3 mL/min，進樣量為1 μL，柱溫40 ℃。②質(zhì)譜條件：正離子離子源電壓為3.7 kV，毛細管加熱溫度320 ℃，翹氣壓206.7 kPa，輔助氣壓68.9 kPa，容積加熱蒸發(fā)溫度300 ℃，翹氣和輔助氣均為氮氣。碰撞氣為氮氣，氣壓為0.2 Pa，一級全掃描參數(shù)為分辨率70 000，自動增益控制目標(biāo)為1×106，最大隔離時間50 ms，質(zhì)荷比掃描范圍50～1 500，液質(zhì)系統(tǒng)由XCalibur 2.2 SP 1.48軟件控制，數(shù)據(jù)采集和靶向代謝物定量處理均由該軟件操作。

1.5.3代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件，進行峰對齊、峰提取、歸一化等處理，代謝物鑒定采用人類代謝組數(shù)據(jù)庫和脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行一級相對分子質(zhì)量匹配，刪除變異系數(shù)超過15%的代謝特征。將整合好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA中進行統(tǒng)計分析，通過無監(jiān)督模式的主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)建立代謝組學(xué)數(shù)據(jù)模型，模型適配程度通過參數(shù)R2X和Q2來評估，R2X>0.50和Q2>0.50表明適配性和預(yù)測性較好；同時，以VIP>1為重要差異代謝物標(biāo)準(zhǔn)。所篩選得到的差異代謝物輸入Metabo Analyst(http：//www.metaboanalyst.ca/)網(wǎng)站中進行通路分析，Impact值>0.1為潛在相關(guān)差異代謝通路。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行處理。各組大鼠代謝產(chǎn)物的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肺組織病理學(xué)觀察對照組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，未見明顯形態(tài)損傷；PM2.5組大鼠肺泡周圍少量炎癥細胞浸潤，肺泡腔滲出增多，肺泡壁斷裂、增厚；當(dāng)歸芍藥散組上述病理損傷有效改善(圖1)。

A：對照組；B：PM2.5組；C：當(dāng)歸芍藥散組

2.2 3組大鼠睪丸組織病理學(xué)觀察對照組大鼠睪丸組織生精細胞排列整齊、致密，形態(tài)基本正常；PM2.5組生精細胞排列稀疏、紊亂，層次由正常6～7層減少至3～4層，且胞漿出現(xiàn)空泡，生精小管內(nèi)精子細胞及精子減少；當(dāng)歸芍藥散組上述病理改變減輕(圖2)。

A：對照組；B：PM2.5組；C：當(dāng)歸芍藥散組

2.3 3組大鼠睪丸組織代謝組學(xué)分析

2.3.1質(zhì)控分析 反相色譜正離子和親水色譜正離子模式下的總離子流圖輪廓總體相似，標(biāo)準(zhǔn)品均能相對聚集在中心點附近。見圖3。

2.3.2代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析 OPLS-DA分析顯示，反相色譜正離子和親水色譜正離子模式下，PM2.5組大鼠睪丸組織代謝輪廓較對照組發(fā)生明顯改變，當(dāng)歸芍藥散組代謝輪廓較PM2.5組發(fā)生明顯改變，介于對照組與PM2.5組之間(圖4)。

A：總離子流圖；B：PCA得分圖；a：反相色譜正離子，b：親水色譜正離子

2.3.3差異代謝物的篩選及通路富集 PM2.5組與對照組比較，共篩選出神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等25個重要差異代謝產(chǎn)物(表1)，富集于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代謝等11條代謝通路(表2)；PM2.5組與當(dāng)歸芍藥散組比較，共篩選出左旋谷氨酰胺、左旋胱氨酸、肌酸等21個差異代謝產(chǎn)物(表3)，富集于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、α-亞麻酸代謝等5條代謝通路(表4)。

表1 對照組、PM2.5組重要差異代謝物

續(xù)表1

表2 對照組、PM2.5組潛在相關(guān)差異代謝通路

表3 PM2.5組、當(dāng)歸芍藥散組重要差異代謝物

表4 PM2.5組、當(dāng)歸芍藥散組差異代謝通路

與對照組相比，PM2.5組大鼠睪丸組織代謝物磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿等含量降低，當(dāng)歸芍藥散組上述產(chǎn)物含量明顯上調(diào)(表5、6)。將上述差異代謝物進行通路分析，共富集于5條代謝通路(表7)，主要為甘油磷脂代謝通路。

表5 3組大鼠磷脂酰乙醇胺類代謝物含量的比較

表6 3組大鼠磷脂酰膽堿類代謝物含量的比較

表7 3組差異代謝通路比較

3 討論

目前全球有5千萬～8千萬人患有不孕不育癥，其中男性因素占所有不育病例的20%～70%[3]。最常見的因素是精子質(zhì)量及活性降低，而日益加重的空氣污染導(dǎo)致的生殖損傷是精子損傷的重要原因之一。本研究結(jié)果表明，PM2.5暴露12周不僅可引起大鼠肺泡壁斷裂、炎癥細胞浸潤等病理變化，還可造成大鼠睪丸組織細胞排列紊亂，生精小管內(nèi)精子及生精細胞減少，而中藥當(dāng)歸芍藥散對此具有較好的改善作用。

中醫(yī)認為霧霾為外來之邪，虛實夾雜為其致病機制，虛為內(nèi)在基礎(chǔ)，實指毒燥濕三氣。毒邪日久耗氣傷正，可致病癥遷延，多變，頑固難愈，導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，進而影響包括生殖功能在內(nèi)的全身功能，治療應(yīng)辨清邪正關(guān)系，以祛邪扶正為主[4-5]。當(dāng)歸芍藥散以肝脾失調(diào)、營虛血瘀、脾虛水濕為病機[6]，方中重用白芍為君，具斂肝、合營、止痛之效，佐以當(dāng)歸、川芎以調(diào)肝、養(yǎng)血活血，配以茯苓、白術(shù)、澤瀉健脾滲濕利水，全方共奏養(yǎng)血活血利水、調(diào)和肝脾、祛瘀毒平陰陽之功。

睪丸是天然缺氧的器官，生殖細胞在其各個發(fā)育階段需利用不同的代謝途徑來產(chǎn)生能量[7-8]。糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝作為機體能量來源，在其中發(fā)揮重要作用。丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及谷氨酰胺是睪丸支持細胞的重要能量底物，在生精能量供應(yīng)中發(fā)揮作用，保證精母細胞和精子的生成與成熟[9]。天冬氨酸可通過與睪丸間質(zhì)細胞及精原細胞中的N-甲基-d-天冬氨酸受體結(jié)合、增強類固醇生成級聯(lián)反應(yīng)中的酶的基因和蛋白質(zhì)表達、直接影響精原體的有絲分裂活性等方式，在脊椎動物睪丸中精子生成過程中發(fā)揮重要作用[10]。甘油磷脂類作為八大脂質(zhì)中重要的一類，不僅是精子細胞膜的重要組成成分，也對精子間的信號傳導(dǎo)起著重要作用，在維持精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵結(jié)合等關(guān)鍵事件中發(fā)揮重要作用[10]。本組資料顯示，PM2.5暴露可引起苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成及鞘脂代謝、甘油磷脂代謝等代謝通路調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等代謝發(fā)生改變。當(dāng)歸芍藥散可能通過調(diào)控甘油磷脂代謝通路，上調(diào)磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等代謝，減輕PM2.5暴露引起的大鼠肺和睪丸組織損傷。

綜上所述，PM2.5暴露可引起雄性大鼠多種代謝紊亂，造成睪丸組織損傷，從而影響雄性生殖功能。當(dāng)歸芍藥散可通過調(diào)控甘油磷脂代謝等多條代謝通路發(fā)揮治療作用，但其具體機制還有待進一步研究。