蔣慶鋒，程紀(jì)偉，程金華，申思寧，錢 鑫，馬曉超，邢文群

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科 鄭州 450008

食管癌是全球常見的一種惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率、病死率不斷上升，成為全球第5大惡性腫瘤死亡原因，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)多見于東亞地區(qū)，來(lái)自中國(guó)的病例超過50%[1]。在食管鱗癌的病理過程中，惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因(CXCR4、ERBB4、IRF2)表達(dá)異常[2]，但其調(diào)控機(jī)制仍不明確。微小RNA是長(zhǎng)約22 nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子，由21～25個(gè)核苷酸組成，它能夠與mRNA結(jié)合，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標(biāo)mRNA而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。微小RNA在不同類型腫瘤中可能靶向不同的基因，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[3]。微小RNA-302b(miR-302b)可能通過靶向作用于部分惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因和相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而在食管鱗癌病理過程中扮演著重要角色，其在食管鱗癌患者癌組織中的表達(dá)下調(diào)往往預(yù)示著患者預(yù)后較差，但關(guān)于此方面的報(bào)道不多[4-5]。本研究觀察了過表達(dá)miR-302b對(duì)食管鱗癌TE-10細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，從而為食管鱗癌的臨床防治提供新的方向和策略。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞及主要試劑

1.1.1標(biāo)本的獲取 收集2018年6月至2020年6月在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科行食管癌根治術(shù)的患者47例，其中男32例，女15例；年齡26～57(41.0±6.9)歲；病程4～7(5.7±1.1)個(gè)月；癌灶處于食管胸上段4例，胸中段25例，胸下段18例；TNM分期：T1期5例，T2期22例，T3期12例，T4期8例。術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)均為食管鱗癌；取癌組織及距離腫瘤組織邊緣超過5 cm的切除標(biāo)本組織(癌旁組織)。

1.1.2細(xì)胞和主要試劑 食管鱗癌TE-10細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。miR-302b模擬物(mimics)、miR-302b-siRNA序列均由上海達(dá)為科生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，RNeasy Plus Mini試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8試劑購(gòu)自北京賽因百奧生物技術(shù)公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司，CXCR4、ERBB4、IRF2一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)自北京博奧龍公司。磷酸鹽緩沖液及多聚甲醛均為市售分析純。

1.2 癌組織與癌旁組織中miR-302b表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)按照Trizol試劑盒說明書步驟提取癌組織和癌旁組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板行qPCR。qPCR反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。miR-302b上游引物序列5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，下游引物序列5’-GATAAGTGCTTCCATGT-3’；內(nèi)參(U6)上游引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，下游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(引物由上海達(dá)為科生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成)。計(jì)算2-ΔΔCt對(duì)miR-302b表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.3 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染TE-10細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約接種3×105個(gè)/細(xì)胞。待細(xì)胞融合度達(dá)65%時(shí)，分別將陰性對(duì)照(轉(zhuǎn)染無(wú)義siRNA)、miR-302b-mimics、miR-302b-siRNA各5 μL，以1∶20的稀釋度加入培養(yǎng)基中。充分混勻，室溫孵育15 min。培養(yǎng)基更換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染1 d，收集生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞。

1.4 TE-10細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測(cè)將1.3中各組細(xì)胞進(jìn)行消化處理，接種至96孔板中，每孔2.0×103個(gè)，置于培養(yǎng)箱(體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃)中培養(yǎng)過夜。加入體積分?jǐn)?shù)10% CCK-8試劑(100 μL/孔)。另設(shè)置空白對(duì)照組(正常的TE-10細(xì)胞，未經(jīng)特殊處理)。均置于37 ℃孵育1 h。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞侵襲的Transwell檢測(cè)于4 ℃下用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基對(duì)基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋，取100 μL鋪于Transwell小室的上室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱1 h。采集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組TE-10細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，1×105個(gè)/小室。下室中加入DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)，置于培養(yǎng)箱(體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，吸去上室中的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液漂洗3次。40 g/L多聚甲醛固定30 min，染色處理，置于熒光倒置顯微鏡下對(duì)所選視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 惡性腫瘤相關(guān)炎癥基因表達(dá)的蛋白免疫印跡法檢測(cè)將1.3中各組細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶1.0×105個(gè)，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，去除培養(yǎng)基，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液漂洗2次。提取細(xì)胞總蛋白，變性5 min，行蛋白定量，行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h。加入一抗(CXCR4按1∶200稀釋，ERBB4、IRF2均按1∶500稀釋)，孵育過夜，洗膜2次，5 min/次。加入二抗(按1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜2次，5 min/次。加入化學(xué)發(fā)光試劑行曝光拍照，以β-actin為內(nèi)參照，用Image J軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)比較食管鱗癌組織與癌旁組織中miR-302b表達(dá)量。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)分析抑制或過表達(dá)miR-302b對(duì)TE-10細(xì)胞增殖、侵襲及TE-10細(xì)胞中CXCR4、ERBB4、IRF2蛋白表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織與癌旁組織中miR-302b表達(dá)量的比較與癌旁組織(1.00±0.05)相比，食管鱗癌組織中miR-302b的表達(dá)量(0.76±0.08)下降(t配對(duì)=17.419，P<0.001)。

2.2 抑制或過表達(dá)miR-302b對(duì)TE-10細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響見表1。由表1可知，miR-302b-siRNA組TE-10細(xì)胞增殖、侵襲能力高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，而miR-302b-mimics組TE-10細(xì)胞增殖、侵襲能力低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。

表1 各組TE-10細(xì)胞增殖、侵襲能力的比較(n=3)

2.3 抑制或過表達(dá)miR-302b對(duì)TE-10細(xì)胞中CXCR4、ERBB4、IRF2蛋白表達(dá)的影響見表2。由表2可知，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，miR-302b-siRNA組CXCR4、ERBB4、IRF2蛋白相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，而miR-302b-mimics組上述蛋白相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05)。

表2 各組TE-10細(xì)胞中CXCR4、ERBB4、IRF2蛋白表達(dá)量的比較(n=3)

3 討論

在人體生理和病理過程中，miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后修飾中扮演著重要的角色，單個(gè)miRNA可調(diào)節(jié)多個(gè)復(fù)雜的信號(hào)通路，其中包括惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因通路[6-7]。有學(xué)者[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-302可通過阻滯PI3K/Akt信號(hào)通路的激活而抑制食管癌TE-10細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為；部分miRNAs在食管癌發(fā)生和發(fā)展過程中出現(xiàn)表達(dá)缺失或表達(dá)量異常改變的情況，可具有與抑癌基因、原癌基因類似的功能[9-10]；研究[11]還發(fā)現(xiàn)，miR-1299在食管癌組織中的表達(dá)較其在癌旁組織中的表達(dá)明顯下降，且與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，提示miR-1299可能是特異性診斷和治療食管癌的潛在標(biāo)志物。

Ibuki等[12]報(bào)道了多個(gè)miRNAs在惡性腫瘤中發(fā)揮著重要作用，其中miR-302b被視為食管鱗癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，可阻滯腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另有研究[13-14]指出，miR-302b-3p可通過靶向調(diào)控ECT2蛋白表達(dá)而阻滯食管癌EC-109細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；miR-302b的表達(dá)經(jīng)芬太尼誘導(dǎo)后可阻滯食管鱗癌細(xì)胞侵襲，并促使ERBB4表達(dá)下降，提示芬太尼可能通過miR-302b/ERBB4通路而阻滯食管鱗癌細(xì)胞侵襲。本研究中，與癌旁組織相比，食管鱗癌組織中miR-302b的表達(dá)量明顯下降，提示miR-302b可能是食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展的預(yù)測(cè)因子。

惡性腫瘤相關(guān)性炎癥是多種炎性細(xì)胞、炎性因子長(zhǎng)時(shí)間的刺激而使得處于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路出現(xiàn)異常，進(jìn)而發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞存活、增殖，抑制獲得性免疫反應(yīng)，加快腫瘤組織內(nèi)新生血管的產(chǎn)生，減弱機(jī)體對(duì)激素類藥物和化療藥物的反應(yīng)等，提示惡性腫瘤相關(guān)性炎癥在腫瘤的病理過程中起重要作用[15-16]。目前已知miR-302b可誘導(dǎo)多種惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因表達(dá)升高，并利用多種信號(hào)通路而誘發(fā)腫瘤的發(fā)病。例如，有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)miR-302b可抑制HIF-1、STAT3、NF-κB等惡性腫瘤相關(guān)性炎癥的重要轉(zhuǎn)錄因子和TNF-α、IL-23、IL-6等下游細(xì)胞因子的表達(dá)，并通過靶向調(diào)控CXCR4、ERBB4、IRF2等關(guān)鍵基因的表達(dá)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法分別探討抑制miR-302b的表達(dá)或使之過表達(dá)后，食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，從而分析其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-302b-siRNA組TE-10細(xì)胞增殖能力高于陰性對(duì)照組，而miR-302b-mimics組TE-10細(xì)胞增殖能力低于陰性對(duì)照組；細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-302b-siRNA組TE-10細(xì)胞侵襲行為較陰性對(duì)照組明顯活躍，而miR-302b-mimics組細(xì)胞侵襲行為較陰性對(duì)照組明顯減弱。另外，本實(shí)驗(yàn)通過蛋白免疫印跡法分別探討抑制miR-302b的表達(dá)或使之過表達(dá)對(duì)惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因(CXCR4、ERBB4、IRF2)的影響，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，miR-302b-siRNA組惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，而miR-302b-mimics組上述基因相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)。上述研究結(jié)果提示，miR-302b可通過抑制信號(hào)通路中的關(guān)鍵惡性腫瘤相關(guān)性炎癥基因，從而影響食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展。

綜上所述，miR-302b可阻滯TE-10細(xì)胞增殖、侵襲，進(jìn)而阻滯食管鱗癌的進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與抑制CXCR4、ERBB4、IRF2基因表達(dá)密切相關(guān)。但miR-302b對(duì)食管鱗癌發(fā)病過程中參與調(diào)控的具體靶基因和信號(hào)通路的作用目前并未明確，需今后進(jìn)一步深入分析。