彭 毅，周文君，鄧 軍

0引言

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)因其具有有效的抗炎和抗免疫作用而被廣泛應(yīng)用于各種全身性及眼部疾病，但長期大量使用糖皮質(zhì)激素可對全身及眼部產(chǎn)生多種副作用。人眼是GC重要的靶器官，局部和全身使用GC都有使眼內(nèi)壓增高的風(fēng)險，誘發(fā)激素性青光眼(glucocorticoid-induced glaucoma, GIG)[1]。GC通過與糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)結(jié)合而發(fā)揮其藥物學(xué)作用。研究顯示，在原位和體外培養(yǎng)的小梁細(xì)胞內(nèi)均有GR的表達，長期使用GC可導(dǎo)致小梁網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)重塑和小梁網(wǎng)功能異常，進而引起房水流出阻力增加，最終導(dǎo)致眼內(nèi)壓的升高[2-3]。但GC誘發(fā)小梁網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能改變的這一生物過程中所涉及的具體致病分子和通路仍不清楚。

隨著高通量基因芯片和測序技術(shù)的發(fā)展，基于基因表達譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析能高效挖掘、篩選與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因和通路。本研究基于公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)中的基因表達數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法分析地塞米松誘導(dǎo)的人小梁網(wǎng)基因表達譜變化，篩選其差異表達的基因，找到關(guān)鍵致病基因及通路，為GIG的分子機制研究提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料數(shù)據(jù)收集和處理：從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)平臺下的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫GEO (http://www.ncbi.nlm.gov/geo/)獲取基因表達數(shù)據(jù)集GSE37474。芯片信息：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，平臺是GPL570。該數(shù)據(jù)集包含5個實驗樣本和5個對照樣本(5對配對供體眼)，所有樣本均來自當(dāng)?shù)匮蹘臁嶒灅颖咎幚恚汗w眼的眼前段組織在含有地塞米松的培養(yǎng)液培養(yǎng)10d。對照樣本處理：供體眼的眼前段組織在不含地塞米松的培養(yǎng)液培養(yǎng)10d。10d后小梁網(wǎng)組織被切除下來用于提取RNA。

1.2方法

1.2.1差異表達基因篩選GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一個基于R語言的Web數(shù)據(jù)分析工具，可對GEO數(shù)據(jù)集中兩組或多組樣本進行差異表達基因分析。我們利用GEO2R對所選的芯片進行差異表達基因篩選及數(shù)據(jù)下載，并將探針名稱轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和|log2FC|>1[差異表達倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)]。

1.2.2GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析將篩選出來的差異表達基因?qū)隓AVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，依據(jù)GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫，以人源基因為背景，對差異表達基因進行生物學(xué)功能注釋。并利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路數(shù)據(jù)庫進行信號通路的富集，尋找差異表達基因所富集的信號通路。

1.2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵樞紐基因的篩選通過STRING 10.5數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，以互作評分combination score>0.4為條件構(gòu)建差異表達基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，利用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件進行拓?fù)鋵W(xué)分析，計算邊緣滲透組件(edge percolated component，EPC) ，度值(Degree) 和最大鄰域組件(maximum neighborhood component，MNC)以篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，并根據(jù)節(jié)點度大小進行排序。最后，對EPC、Degree 和MNC分別篩選出的前10個重要節(jié)點取交集得出本研究的關(guān)鍵樞紐基因。

1.2.4關(guān)鍵樞紐基因RT-PCR驗證人小梁網(wǎng)細(xì)胞購于上海拜力生物公司，小梁網(wǎng)細(xì)胞分為兩組：實驗組用含100 nmol/L地塞米松的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10d，對照組用不含地塞米松的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)10d。用Trizol提取細(xì)胞RNA，Nanodrop測RNA濃度，使用Prime Script RT試劑盒合成cDNA，用SYBR Green Master Mix試劑盒對篩選出來的關(guān)鍵樞紐基因的表達量進行RT-PCR檢測驗證。使用ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達量。

2結(jié)果

2.1地塞米松處理的小梁網(wǎng)組織和正常小梁網(wǎng)組織之間的差異表達基因本研究選擇的基因表達譜芯片GSE37474包括5對配對樣本，地塞米松處理的小梁網(wǎng)組織的5個樣本為實驗組，無地塞米松處理的小梁網(wǎng)組織的5個樣本為對照組。以P<0.05和|log2FC|>1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達基因。與正常小梁網(wǎng)組織相比，地塞米松處理的小梁網(wǎng)組織有252個基因存在差異表達，其中141個為上調(diào)基因，111個為下調(diào)基因，見火山圖(圖1A)和差異基因聚類熱圖(圖1B)。

圖1 地塞米松處理的小梁網(wǎng)組織和正常小梁網(wǎng)組織之間的差異表達基因圖 A：基因火山圖；B:聚類熱圖。

2.2差異表達基因GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析252個差異表達基因GO功能注釋結(jié)果顯示(圖2A), 差異表達基因主要定位于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞外泌體、肌原纖維Z盤、細(xì)胞基底膜和細(xì)胞表面等細(xì)胞成分( cell component，CC)；主要參與炎癥的正調(diào)控和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等生物學(xué)過程( biological processes，BP)；主要參與細(xì)胞因子活性、肝素結(jié)合和生長因子活性等分子功能( molecular function，MF)。KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示(圖2B)，差異表達基因主要參與血管平滑肌收縮、花生四烯酸代謝、醚脂質(zhì)代謝和癌癥膽堿代謝等相關(guān)信號通路。

圖2 差異表達基因GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析 A：差異表達基因的GO 功能注釋;B:KEGG 通路功能富集分析。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵樞紐基因的篩選用STRING 10.5數(shù)據(jù)庫和Cytoscape構(gòu)建差異表達的基因之間蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。去除游離的蛋白影響后，得到了由179個節(jié)點，443條邊構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)(圖3A)。用Cytoscape 軟件中的CytoHubba插件對網(wǎng)絡(luò)進行分析，基于EPC(邊緣滲透組件)、Degree(度)和MNC(最大鄰域組件)三種拓?fù)渌惴ǚ謩e探索PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10個重要節(jié)點(圖3B、C、D和表1)。將上述三種算法所獲得結(jié)果取交集，得出7個重疊差異表達基因，即關(guān)鍵樞紐基因，其中包括3個上調(diào)基因EDN1、FOS、LPL和4個下調(diào)基因CCL2、IGF1、PTGS2、CCL5(圖4和表2)。

表1 基于EPC和Degree及MNC算法分別得出的前10名基因

圖3 差異表達基因的PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵樞紐基因的篩選(紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因) A：差異表達基因構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)；B：EPC算法中排名前10名的基因；C：Degree算法中排名前10名的基因；D：MNC算法中排名前10名的基因。

表2 基于EPC和Degree及MNC算法中前10名基因的交集

2.4關(guān)鍵樞紐基因RT-PCR驗證對篩選出來的7個關(guān)鍵樞紐基因(CCL2、IGF1、PTGS2、EDN1、FOS、CCL5、LPL)進行RT-PCR驗證(相關(guān)引物見表3)。相比正常小梁網(wǎng)組織，地塞米松處理的小梁網(wǎng)細(xì)胞中CCL2(P=0.006)，IGF1(P=0.001)，PTGS2(P=0.003)和CCL5(P=0.017)的mRNA表達量下降，而EDN1 (P=0.018)，F(xiàn)OS(P=0.004)和LPL(P=0.023)的mRNA表達量上升，結(jié)果和基因表達譜芯片一致(圖5)。

表3 關(guān)鍵樞紐基因RT-PCR引物序列

圖4 EPC和Degree及MNC算法中前10名基因交集的韋恩圖。

圖5 關(guān)鍵樞紐基因的RT-PCR驗證 aP<0.05, bP<0.01 vs 正常小梁網(wǎng)組織。

3討論

GIG的發(fā)病機制被認(rèn)為和開角型青光眼相似，但其具體發(fā)病機制目前仍不清楚，目前認(rèn)為可能與GC引起的小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)重塑有關(guān)[4-6]。GO功能注釋結(jié)果提示，地塞米松引起的小梁網(wǎng)組織差異基因主要位于細(xì)胞外區(qū)域，參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑。這一結(jié)果表明，GC引起的小梁網(wǎng)變化主要發(fā)生在細(xì)胞外基質(zhì)。KEGG通路分析顯示差異基因主要參與血管平滑肌收縮、花生四烯酸代謝、醚脂質(zhì)代謝和癌癥膽堿代謝等相關(guān)信號通路。血管平滑肌細(xì)胞上存在GC受體，GC可誘導(dǎo)上調(diào)血管平滑肌細(xì)胞表達去甲腎上腺素和血管緊張素Ⅱ受體，引起血管收縮，使外周阻力增加，被認(rèn)為是GC誘發(fā)高血壓的機制之一[7-9]。但目前尚無文獻報道GC引起的血管收縮是否在GIG的發(fā)病中起作用。KEGG分析提示差異基因還富集在脂質(zhì)代謝過程，包括花生四烯酸代謝和醚脂質(zhì)代謝，提示脂質(zhì)代謝可能參與了GIG的發(fā)病。國外研究發(fā)現(xiàn)血脂水平升高和眼壓水平增高呈正相關(guān)，且長期服用他汀類藥物可以降低眼壓[10-11]。國內(nèi)亦有研究報道，血總膽固醇水平與原發(fā)性開角型青光眼和眼壓具有相關(guān)性[12]。脂質(zhì)代謝中花生四烯酸代謝和醚脂質(zhì)代謝參與GIG發(fā)病的具體機制仍需進一步研究。另外，在開角型青光眼患者的房水中二?；视土姿崮憠A和?；视土姿崮憠A水平升高[13]。Leruez等[14]亦報道相對于正常人，開角型青光眼患者血漿中磷脂酰膽堿水平升高。結(jié)合KEGG通路富集結(jié)果，提示異常的膽堿代謝可能在GIG的病理生理學(xué)中起重要作用。

在最終確定的7個關(guān)鍵樞紐基因中，趨化因子(C-C基序)配體2(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)在三種算法中都顯示出最高的相關(guān)程度(得分最高)，且在地塞米松處理組表達下調(diào)。CCL2也被稱為單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)，是促炎因子之一，可被內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。正常的小梁網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞在沒有刺激的情況下會分泌大量的CCL2[15]。有研究表明，CCL2可通過改變Schlemm管內(nèi)皮細(xì)胞間的接觸來增加房水流出，從而降低眼壓[16]。然而有研究報道，在開角型青光眼患者的房水中CCL2水平是升高的[17]。而本研究的結(jié)果提示CCL2在GIG中是下降的，這可能與GC可以下調(diào)CCL2的表達有關(guān)。CCL2在GC誘導(dǎo)的青光眼中的生理作用需要進一步研究。胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)在地塞米松處理組亦表現(xiàn)為下調(diào)，IGF1可由小梁網(wǎng)細(xì)胞表達，被認(rèn)為可促進基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生及減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，改善房水流出[18]。因此，IGF1的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積可能是GIG的發(fā)病機制之一。但有報道稱開角型青光眼患者房水中IGF1表現(xiàn)為上調(diào)[19]，IGF1在開角型青光眼中的升高可能是機體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。其他2個下調(diào)基因，前列腺素氧化環(huán)化酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)和趨化因子(C-C基序)配體5(CCL5)，在青光眼研究中并未見報道，其表達和功能仍值得研究。

在上調(diào)基因中，內(nèi)皮素1(endothelin 1,EDN1)是另一個重要的樞紐基因。EDN1是目前最強的血管收縮肽，在調(diào)控血管舒縮、細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要作用。同時，EDN1還具有強大的促纖維化作用，通過多種途徑促進成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等合成細(xì)胞外基質(zhì)，并干擾組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蓄積。EDN1通過活化Rho激酶來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化，從而介導(dǎo)細(xì)胞骨架的重構(gòu)。在眼部，房水流出通道上小梁網(wǎng)和Schlemm管中含有豐富EDN1及其受體。非色素性睫狀上皮細(xì)胞可能是眼組織中EDN1產(chǎn)生的一種來源[20]。在原發(fā)性開角型青光眼、正常眼壓青光眼，色素剝脫綜合癥患者和青光眼動物模型房水中，EDN1的水平比正常明顯升高，因此認(rèn)為其與青光眼發(fā)病密切相關(guān)[21]。GC可刺激EDN1的表達[22]，因此在GIG中，GC可能通過上調(diào)EDN1從而導(dǎo)致小梁網(wǎng)細(xì)胞外基質(zhì)增加和/或改變小梁細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)，引起房水流出阻力增加，最后導(dǎo)致眼壓增高。

綜上，通過生物信息學(xué)分析，我們認(rèn)為地塞米松引起的人小梁網(wǎng)病理改變主要在細(xì)胞外基質(zhì)，引起的通路改變主要集中在血管平滑肌收縮、花生四烯酸代謝、醚脂質(zhì)代謝和膽堿代謝，篩選出的7個關(guān)鍵樞紐基因中，有3個基因被報道與房水調(diào)節(jié)有關(guān)，包括2個下調(diào)基因(CCL2和IGF1)和一個上調(diào)基因(EDN1)，這3個基因在GIG的發(fā)病機制中可能起著重要作用。其他2個下調(diào)基因(PTGS2和CCL5)和2個上調(diào)基因(FOS和LPL)，在青光眼研究中并未見報道，其在青光眼中的作用仍值得探索。