于姍姍 ，李學(xué)玉 ，何振平，王青林,，孫桂清，付仲

(1.河北科技師范學(xué)院 海洋資源與環(huán)境學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.河北省海洋動力過程與資源環(huán)境重點實驗室，河北秦皇島 066004；3.秦皇島市海洋生境與資源重點實驗室，河北 秦皇島 066004；4.河北省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，河北 秦皇島 066004；5.河北省海洋與水產(chǎn)科學(xué)研究院（河北省海洋漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站），河北 秦皇島 066004)

1 引言

刺參（Apostichopus japonicus）為淺海底、溫帶物種，主要分布于35°～44°N 的西北太平洋沿岸[1]。作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，刺參能夠分解海底生物碎屑，在碳循環(huán)中發(fā)揮著極其重要的作用[2-4]。此外，由于刺參具有極高的藥用滋補(bǔ)作用，其消費市場需求不斷升高，養(yǎng)殖產(chǎn)量和增養(yǎng)殖規(guī)模隨之增長，其已成為我國北方和東南沿海重要的養(yǎng)殖種類之一[5]。據(jù)統(tǒng)計，2020 年全國刺參產(chǎn)量為1 965 64 t（占海水養(yǎng)殖總量的0.92%），年總產(chǎn)值高達(dá)315 億元（占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)值的8.20%）[6]。但是，作為一種水生變溫生物，刺參對高溫和低鹽等環(huán)境脅迫非常敏感，2013 年、2016 年和2018 年夏季的極端高溫天氣和暴雨導(dǎo)致了池塘養(yǎng)殖刺參的大幅減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)。然而，全球氣候變化背景下的極端高溫天氣和短時強(qiáng)降雨頻發(fā)，導(dǎo)致高溫期大量淡水注入刺參池塘，從而使養(yǎng)殖海水鹽度大幅降低，而且這種持續(xù)的高溫和低鹽狀況在河口地區(qū)更嚴(yán)重[7-8]，給刺參池塘養(yǎng)殖帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。因此，研究極端環(huán)境下刺參的生理響應(yīng)，對刺參產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

刺參的適宜生長溫度為10～20℃，且隨著刺參規(guī)格的增大而降低，體長為5～15 cm 的刺參的最適生長溫度為10～15℃[9]。諸多研究表明[1,10-13]，溫度對刺參的生長、耗氧率、酶活力、攝食行為、腸道質(zhì)量、配子的受精能力、熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）表達(dá)等各方面都有顯著的影響。鹽度是影響水生生物的另一個重要生態(tài)因子，作為狹鹽性的棘皮動物，刺參對鹽度的耐受程度有限，其適宜生長鹽度為28～34[14]。鹽度變化能顯著影響刺參的呼吸代謝、能量轉(zhuǎn)換和生長等，當(dāng)鹽度低于22 時，可造成刺參大量死亡[15-16]。在遭受溫度、鹽度等環(huán)境因子脅迫時，水生生物體內(nèi)會誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP[17-18]。誘導(dǎo)型HSP 是指生物體在不利環(huán)境因素刺激下應(yīng)激合成的一組在結(jié)構(gòu)上高度保守、具有重要生理功能的特殊蛋白質(zhì)分子家族。它最主要的功能是作為分子伴侶，可修復(fù)錯誤折疊蛋白、降解變性蛋白等[19-20]。研究表明[10,21]，hsp70和hsp90基因在刺參抵抗溫度和鹽度脅迫的過程中發(fā)揮重要的作用。熱休克蛋白基因表達(dá)量與生物體的熱耐受性有關(guān)，且生物前期經(jīng)歷的高溫脅迫能誘導(dǎo)熱休克蛋白高表達(dá)來防止蛋白損傷和聚集[22-23]。長期環(huán)境脅迫對生物來說是一種馴化，是指通過實驗誘導(dǎo)，使生物對某種生態(tài)因子的耐受性增強(qiáng)的過程[10,24]。這種脅迫能增加生物對新環(huán)境的適應(yīng)性，特別是細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理生化能隨著環(huán)境條件的改變而改變[25]。溫度和鹽度單因子脅迫對刺參的影響已有報道[10,22,26]，但由于hsp基因具有交叉耐受性，一種環(huán)境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的hsp基因不僅能夠提高機(jī)體對該種脅迫的耐受性，同時也能增加對于其他環(huán)境脅迫的耐受能力[27-28]。因此，有必要研究多環(huán)境因子尤其是極端天氣導(dǎo)致的持續(xù)性高溫和低鹽協(xié)同脅迫對刺參生長和誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因表達(dá)的影響。

為應(yīng)對極端天氣帶來的挑戰(zhàn)，刺參從業(yè)者們采取了提高池塘水位、安裝增氧降溫設(shè)備、排表層淡水等一系列措施，起到了一定的效果。提高刺參自身抵抗逆境的能力也是非常關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)，這需要科研工作者加強(qiáng)多環(huán)境因素脅迫下刺參響應(yīng)機(jī)制相關(guān)的研究，進(jìn)而探索提高刺參抵抗逆境能力的途徑。因此，本研究通過分析高溫和低鹽長期協(xié)同脅迫（40 d）對刺參幼參生長和誘導(dǎo)型hsp70和hsp90基因表達(dá)的影響，探討兩個外源性因子對刺參的交互影響，從而為指導(dǎo)極端天氣下刺參生產(chǎn)實踐，促進(jìn)刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展提供一定的理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

實驗用刺參幼參購自山東省青島市養(yǎng)殖場。選取體表無損傷且活力好的刺參幼參在溫度為16℃，鹽度為32 的海水中暫養(yǎng)兩周。暫養(yǎng)期間每天足量投喂1 次配合飼料（主要成分：粗蛋白（18.58±0.23）%、脂肪（2.67±0.06）%、灰分（42.66±0.54）%、水分（9.94±0.17）%）。每天更換1/3～1/2 溫度為16℃，鹽度為32 的新鮮沙濾海水以保證養(yǎng)殖水質(zhì)。暫養(yǎng)期間持續(xù)充氣，光照周期設(shè)置為14 h∶10 h（白天∶黑夜），pH為7.8～8.2，氨氮含量低于0.24 mg/L。

2.2 實驗設(shè)計

實驗設(shè)置4 個溫度梯度（16℃、20℃、24℃和28℃）和3 個鹽度梯度（22、27 和32），共12 個組合，每個組合3 個重復(fù)。將經(jīng)過暫養(yǎng)的216 頭刺參幼參隨機(jī)分配到36 個規(guī)格為450 mm×250 mm×350 mm（長×寬×高）的玻璃缸中，每缸6 頭。采用水浴法并每天升高0.5～1℃的溫度，采用向自然海水中添加曝氣自來水的方法每天降低1～2 的鹽度，直至到達(dá)實驗設(shè)定溫度和鹽度，并在設(shè)定溫度和鹽度下持續(xù)40 d。

2.3 不同溫鹽協(xié)同脅迫下幼參的生長

刺參幼參饑餓24 h 后稱量初始濕體重，平均體重為（3.541±0.046）g。實驗期間每天足量投喂1 次配合飼料，每日換水1 次，換水前將沙濾海水調(diào)整到實驗所需的溫度和鹽度。每20 d 稱量體重1 次，實驗持續(xù)40 d。實驗結(jié)束后，刺參幼參饑餓24 h 后稱重，并計算幼參每天的特定生長率（Specific Growth Rate,SGR），公式為

式中，W2和W1分別表示刺參幼參的末體重和初始體重；D為實驗持續(xù)的時間。

2.4 誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因的表達(dá)

2.4.1 樣品的獲取

將經(jīng)過40 d 高溫和低鹽協(xié)同脅迫的刺參幼參轉(zhuǎn)移至溫度為30℃，鹽度為20 的海水中急性脅迫2 h，之后在溫度為16℃，鹽度為32 的自然海水中進(jìn)行恢復(fù)。在恢復(fù)6 h 的每個處理組隨機(jī)取4 頭刺參，迅速保存于液氮中。并取自然海水中的刺參作為空白對照。帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4.2 引物設(shè)計

本實驗中選取的2 條基因（hsp70，hsp90）篩選自NCBI 刺 參cDNA 文 庫（Ajhsp70，GH 985449；Ajhsp90，JF907619）。實驗中使用的引物（Hsp70-F 和Hsp70-R，Hsp90-F 和Hsp90-R）見表1。以刺參的部分β-actin 序列（312 bp）作為內(nèi)參基因，其引物序列來自文獻(xiàn)[17]。

表1 用于本實驗的引物序列Table 1 Primers used in this study

2.4.3 總RNA 提取和基因表達(dá)分析

利用Trizol 試劑從體重約為80 mg 刺參體壁組織中提取總RNA。cDNA 第一鏈利用Oligo dT18 作為引物合成。合成的第一鏈cDNA 通過內(nèi)參基因PCR檢驗其是否可用。PCR反應(yīng)體系25μL，包括：2.5μL10×PCR擴(kuò)增緩沖液、1.6μLMgCl2（25mmol/L）、2.0μLdNTPs（2.5mmol/L）、各1μL的上下游引物（10pmol/mL）、15.875μL滅菌水、0.125μL（5U/μL）TaqDNA聚合酶以及1μLcDNA模板。hsp70和hsp90反應(yīng)程序為94℃反應(yīng)5 min，接著是94℃ 45 s，53℃ 45s,72?C 1 min，30 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min；內(nèi)參基因反應(yīng)程序為94℃反應(yīng)5 min，接著是94℃ 45s，55℃ 45s,72?C 1 min，28 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物使用EB 染色的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，為了確保PCR 反應(yīng)的特異性，產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并測序。電泳圖使用GeneTools 軟件分析，基因相對表達(dá)量通過其電泳圖中光密度值與內(nèi)參基因光密度值的比值表示。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用IBM SPSS Statistics 21.0 進(jìn)行。用K-S 檢驗和Levene 檢驗分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊次性檢驗。應(yīng)用雙因子方差分析（Two-way ANOVA）分析溫度和鹽度協(xié)同脅迫對刺參體重、特定生長率以及熱休克蛋白基因表達(dá)量的交互作用。采用Tukey’s 多重比較進(jìn)行處理間的顯著性檢驗，以p＜0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 高溫和低鹽協(xié)同脅迫對刺參幼參生長的影響

各組間刺參幼參的初始體重?zé)o顯著差異（F11，24=0.401，p=0.942），經(jīng)過40 d 實驗，各組刺參幼參的末體重差異顯著（F11，24=69.534，p＜0.001）（表2）。在同一鹽度下，刺參幼參的末體重隨溫度的升高而下降。在同一溫度下，刺參幼參的末體重隨鹽度的降低也呈下降的趨勢。其中溫度為16℃、鹽度為32 組的刺參幼參末體重最大，溫度為28℃、鹽度為22 組的末體重最小，并且在此處理組，刺參幼參出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。雙因子方差分析顯示，溫度和鹽度對刺參幼參體重均有顯著性影響（溫度：F3，24=172.761，p＜0.001；鹽度：F2，24=114.546，p＜0.001），且兩者的交互作用顯著（F6，24=2.917，p=0.028）（表3）。

表2 高溫和低鹽協(xié)同脅迫對刺參幼參生長的影響Table 2 Effects of high temperature and low salinity collaborative stress on growth of juvenile Apostichopus japonicus

各處理組刺參幼參的特定生長率不同（圖1）。從圖上可以看出，經(jīng)過40 d 實驗，溫度和鹽度對刺參幼參的特定生長率影響差異顯著（F11，24=87.132，p＜0.001），在同一溫度或鹽度下，SGR 均隨著鹽度的降低以及溫度的升高而下降。雙因子方差分析顯示，溫度和鹽度對刺參幼參的SGR 均有顯著性影響（溫度：F3，24=220.109，p＜0.001；鹽度：F2，24=143.439，p＜0.001），但是兩者的交互作用不顯著（F6，24=1.874，p=0.127）（表3）。

圖1 高溫和低鹽協(xié)同脅迫對刺參幼參特定生長率的影響Fig.1 Effects of high temperature and low salinity collaborative stress on specific growth rate of juvenile Apostichopus japonicus

表3 溫度和鹽度對刺參幼參生長的雙因子方差分析Table 3 Two-way ANOVA of growth for the juvenile Apostichopus japonicus maintained in different temperature and salinity

3.2 高溫、低鹽協(xié)同脅迫對刺參幼參誘導(dǎo)型hsp70 和hsp90 基因表達(dá)的影響

雙因子方差分析結(jié)果表明，溫度對hsp70和hsp90相對表達(dá)量具有顯著影響（hsp70：F3，24=7.207，p=0.001；hsp90：F3，24=8.541，p＜0.001）。但是鹽度以及兩者的交互作用對基因表達(dá)量的影響不顯著（hsp70：鹽度：F2，24=2.502，p=0.103；交互作用：F6，24=0.159，p=0.985；hsp90：鹽度：F2，24=1.861，p=0.177；交互作用：F6，24=0.157，p=0.986）（表4）。

表4 溫度和鹽度對刺參幼參誘導(dǎo)型hsp 基因表達(dá)量的雙因子方差分析Table 4 Two-way ANOVA of hsp gene expression for the juvenile Apostichopus japonicus maintained in different temperature and salinity levels

圖2a 為刺參幼參hsp70基因的相對表達(dá)量，各組間表達(dá)量差異顯著（F11，24=2.508，p=0.029）。在同一鹽度下，不同溫度組刺參幼參hsp70基因表達(dá)量均在溫度為28℃時最大，并且表達(dá)量隨著馴化溫度的升高而上升（圖2a）。在同一溫度下，鹽度為32 時，hsp70基因相對表達(dá)量最少。溫度為16℃和20℃時，hsp70基因相對表達(dá)量隨著鹽度的降低而升高，但是溫度為24℃和28℃時，鹽度27 條件下的表達(dá)量最大，鹽度22 時出現(xiàn)小幅度的下降。

圖2 高溫和低鹽協(xié)同脅迫對刺參幼參hsp70（a）以及hsp90（b）表達(dá)的影響Fig.2 Effects of high temperature and low salinity collaborative stress on hsp70 (a) and hsp90 (b) expression of juvenile Apostichopus japonicus

刺參幼參hsp90基因的相對表達(dá)量見圖2b。從圖上可以看出，hsp90的表達(dá)趨勢與hsp70基本相同。即在同一鹽度下，hsp90相對表達(dá)量隨著馴化溫度的升高而上升；在同一溫度下，鹽度從32 下降到27 時，hsp90相對表達(dá)量上升，鹽度從27 下降到22 時，hsp90相對表達(dá)量或升或降。

4 討論

我國刺參的養(yǎng)殖方式主要有池塘養(yǎng)殖、圍堰養(yǎng)殖、工廠化養(yǎng)殖、底播養(yǎng)殖、吊籠養(yǎng)殖和網(wǎng)箱養(yǎng)殖，其中池塘養(yǎng)殖面積最大，主要集中在渤海和黃海的潮間帶地區(qū)[29-30]。這種室外池塘的水質(zhì)條件易受天氣的影響，夏季高溫期的持續(xù)暴雨天氣會使大量淡水注入池塘，導(dǎo)致池塘海水鹽度在十幾個小時內(nèi)從30 陡降至20 以下，而且這種高溫、低鹽的狀況在河口地區(qū)更為突出，并且會持續(xù)相當(dāng)長一段時間[31]，給刺參池塘養(yǎng)殖造成了巨大的損失。

刺參屬于一種溫帶和狹鹽生物，溫度、鹽度過低和過高對其生長和存活都有很大的影響。本研究的結(jié)果顯示，溫度為16℃和鹽度為32 時刺參幼參的體重以及特定生長率要明顯高于其他處理組（表2，圖1）。且隨著溫度的升高以及鹽度的降低，幼參的體重增加量減少，甚至在溫度為24℃、鹽度為22 以及溫度在28℃以下的鹽度27 和鹽度22 處理組，刺參幼參的體重下降。這說明，在高溫脅迫下，刺參幼參對低鹽脅迫的耐受能力降低。溫度和鹽度單因子脅迫對刺參生長影響的研究已有報道。Wang 等[22]研究表明，高溫脅迫下刺參的生長速率降低，原因主要有3 個：（1）高溫脅迫下攝食量較少；（2）高溫脅迫下耗氧率升高，呼吸耗能增加；（3）高溫脅迫下hsps合成以及發(fā)揮功能所產(chǎn)生的能量消耗高。趙斌等[32]對比5 個鹽度梯度（23、27、31、35 和39）下刺參的生長發(fā)現(xiàn)，生長率隨著鹽度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在鹽度為31 時達(dá)到最大值。王欠欠等[33]研究進(jìn)一步表明，低鹽度下刺參需要更多的能量來用于滲透壓調(diào)節(jié)，這是導(dǎo)致低鹽度下刺參負(fù)增長的一個重要的原因。本研究中，在高溫和低鹽的協(xié)同脅迫下，刺參幼參需要消耗更多的能量用于維持機(jī)體的正常機(jī)能，在外源能量攝入減少的前提下，體重下降成為一種必然結(jié)果。因此，在刺參池塘養(yǎng)殖過程中，高溫暴雨季節(jié)要采取有效措施調(diào)節(jié)海水鹽度，避免鹽度的大幅降低。此外，高溫季節(jié)池塘底部有機(jī)質(zhì)、雜草等物質(zhì)容易發(fā)酵，產(chǎn)生大量熱量，造成底熱。由于刺參屬于底棲生物，要及時打破這種底熱造成的養(yǎng)殖水體分層現(xiàn)象，促進(jìn)上下層水體交換，避免造成更大的損失。

雖然隨著脅迫溫度的升高和脅迫鹽度的降低，幼參的體重呈下降趨勢。但是高溫脅迫下刺參幼參的誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因的表達(dá)量要高于低溫脅迫組（圖2）。說明長期高溫脅迫能提高機(jī)體在急性熱脅迫下合成熱休克蛋白的能力，并保持高水平的表達(dá)量來防止蛋白變性和聚集[25,34-35]。長期環(huán)境脅迫對生物來說是一種馴化，而馴化溫度是影響生物耐熱性的關(guān)鍵環(huán)境因素之一[10,36]。生活在不同區(qū)域的同一生物對溫度的耐受程度不同，且生物體的致死溫度受到其前期所經(jīng)歷環(huán)境溫度的很大影響[11,37]。俞丹等[38]通過比較不同水溫條件下馴化的尖頭鳉（Rhynchocypris oxycephalus）的熱耐受特征發(fā)現(xiàn)，尖頭鳉耐受的最大臨界溫度隨馴化溫度的升高而升高，說明尖頭鳉的熱耐受性明顯有賴于馴化溫度。此外，生物體會對長時間的溫度馴化產(chǎn)生適應(yīng)機(jī)制，包括對環(huán)境因子變化的感知、將外界信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)以及細(xì)胞內(nèi)分子伴侶的激活等[39]。作為重要的分子伴侶，當(dāng)應(yīng)對高溫脅迫時，機(jī)體通過誘導(dǎo)和表達(dá)熱休克蛋白來緩解熱脅迫帶來的損傷[17,34,40-41]。

hsp基因具有交叉耐受性，高溫脅迫誘導(dǎo)的hsp可以增加機(jī)體抵抗氨氮[42]、弧菌[28]、鹽度[27]等脅迫的能力。本研究中，在溫度為24℃和28℃時，鹽度為22 的處理組刺參幼參誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因的表達(dá)量較鹽度為27 時低，但是差異并不顯著（圖2）。可能的原因是，經(jīng)過長期高溫脅迫，刺參誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)的起始鹽度以及表達(dá)量達(dá)到峰值時的鹽度較低溫脅迫的個體降低。因此對其進(jìn)行鹽度20 的脅迫，誘導(dǎo)熱休克蛋白基因的表達(dá)量尚未達(dá)到最大值。這與前人報道的實驗生物的誘導(dǎo)熱休克蛋白開始表達(dá)的最低溫度和達(dá)到峰值時的最高溫度以及誘導(dǎo)熱休克蛋白的最大表達(dá)量會隨著馴化溫度的升高而增加的研究結(jié)果相似[43-44]。但是，熱休克蛋白的表達(dá)是耗能的過程[45]，高溫及低鹽條件下熱休克蛋白的表達(dá)量較高，需要消耗大量的能量，這也是在此條件下刺參生長緩慢的原因之一。

Wang 等[17]通過研究溫度和鹽度雙因子急性脅迫下刺參滲透壓和基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，鹽度變化后，相對于低溫處理組，高溫處理組刺參體腔液滲透壓變化速度更快，而且相較于鹽度因子，溫度因子對熱休克蛋白表達(dá)的影響更為顯著。本研究中，高溫和低鹽對特定生長率和誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因表達(dá)量的交互作用均不顯著，并且鹽度對誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因表達(dá)量也沒有顯著的影響（表3，表4）。這也說明高溫比低鹽對刺參幼參的影響更大。因此可以將高溫作為選擇壓力開展刺參新品系選育工作，選育的個體在獲得耐高溫特性的同時可能對低鹽也有一定的耐受能力。此外，刺參對溫度和鹽度的耐受性具有可塑性[26,46]。在高溫和低鹽條件下馴化的刺參幼參在遭受溫度30℃、鹽度20 的急性脅迫時，誘導(dǎo)型熱休克蛋白表達(dá)量具有相對較高的水平。這說明經(jīng)過高溫和低鹽馴化，刺參幼參具有較強(qiáng)的耐高溫和耐低鹽的能力，并能夠增加在相應(yīng)極端條件脅迫下的誘導(dǎo)型熱休克蛋白的合成，防止脅迫導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性和聚集，從而維持機(jī)體的正常功能。

綜上所述，本研究通過分析長期高溫和低鹽協(xié)同脅迫下刺參幼參的生長以及誘導(dǎo)型熱休克蛋白基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)相較低鹽，高溫對刺參幼參的影響更大。長期高溫、低鹽協(xié)同脅迫增加了刺參幼參誘導(dǎo)型hsp70和hsp90基因表達(dá)量，進(jìn)而在一定程度上提高了刺參幼參應(yīng)對高溫季節(jié)暴雨環(huán)境的能力。高溫期應(yīng)該采取有效措施降低海水溫度，并防止養(yǎng)殖池塘底熱造成的養(yǎng)殖水體分層，避免損失。該研究豐富了刺參生理生態(tài)學(xué)理論，為刺參良種選育工作提供思路，為指導(dǎo)極端天氣下刺參生產(chǎn)實踐活動提供一定的理論依據(jù)。