孔令露，梁 幸，沈賀彬

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350117)

民以食為天，食以安全為先，食品安全與社會穩(wěn)定及人類的健康密切相關(guān)。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)數(shù)據(jù)顯示，全球約有25%糧食農(nóng)作物受到真菌毒素的污染[1]。真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌產(chǎn)生的天然次級代謝產(chǎn)物，世界衛(wèi)生組織( World Health Organization, WHO) 將其對食品與飼料造成的污染列為食源性疾病的重要根源[2]。黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)主要是由黃曲霉Aspergillusflavus、寄生曲霉Aspergillusparasiticus和諾氏曲霉Aspergillusnomius等真菌產(chǎn)生的有害毒素[3]。已鑒定的黃曲霉毒素種類有20多種，常見的主要有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等，且毒性從大到小依次是：AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG2，其中黃曲霉毒素B1( Aflatoxin B1, AFB1)作為毒性最強的生物毒素，毒性約為氰化鉀(KCN)的10倍和砒霜(As2O3)的68倍[4]，可在人或動物體內(nèi)蓄積，具有致畸、致癌、致突變等作用，1993年被國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)定為I級致癌物質(zhì)，目前是人們公認(rèn)天然毒性最強的化合物之一[5]。AFB1污染給人類健康和經(jīng)濟發(fā)展造成了巨大的威脅，如何降低食品中黃曲霉毒素B1的含量，減少其帶來的危害成為當(dāng)下食品安全的一大難題。目前主要的脫毒方法包括物理、化學(xué)以及生物法，不同的脫毒方法各有其優(yōu)缺點，本文將對3種主要的脫毒手段和優(yōu)缺點加以概述，旨在為今后更好地認(rèn)識和去除AFB1提供理論參考。

1 AFB1毒性位點分析

AFB1作為劇毒化合物，是由1個雙呋喃環(huán)和1個氧雜萘鄰?fù)M成的香豆素衍生物，其含有3個毒性位點(圖1)，毒性位點1位于雙呋喃環(huán)上的第8、9雙鍵上，且是AFB1高毒性的關(guān)鍵[6]，該位點主要是與DNA/RNA和蛋白質(zhì)共價結(jié)合形成加合物，從而影響細(xì)胞的代謝，同時也是導(dǎo)致基因突變的主要功能基團；毒性位點2位于香豆素內(nèi)酯環(huán)上的10、11、15位點，該位點易發(fā)生水解反應(yīng)生成含雙呋環(huán)結(jié)構(gòu)的AFD1；毒性位點3位于環(huán)戊烯酮環(huán)上的1、2、3、14位點上，該位點容易被取代基所取代，如發(fā)生酮羰基還原、加成作用等反應(yīng)來改變AFB1的毒性。因此，破壞3個相應(yīng)的毒性位點成為了AFB1減毒、脫毒的重要關(guān)鍵。

圖1 黃曲霉毒素B1的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of Aflatoxin B1

2 AFB1污染情況分析

黃曲霉毒素B1的污染是一個全球性的問題，AFB1引起的食品污染問題時常發(fā)生，根據(jù)過去10年全球污染率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，AFB1污染最高濃度達(dá)1 642 μg·kg-1，其中水稻污染率位居第3，平均有55.4%的水稻樣本被AFB1污染[7-8]。Bansal等[9]對加拿大199份水稻樣本進(jìn)行檢測，其中56份樣本呈現(xiàn)AFB1陽性，濃度達(dá)7.1 μg·kg-1。此外，飼料和部分農(nóng)產(chǎn)品也常受到AFB1的污染，被污染的飼料和農(nóng)產(chǎn)品通過食物鏈的傳遞將導(dǎo)致AFB1在人體內(nèi)直接或間接的蓄積。目前已超過百種農(nóng)產(chǎn)品和食品檢測出受到AFB1的污染，尤其是在氣候濕熱的地區(qū)，部分熱帶和亞熱帶地區(qū)AFB1的污染情況見表1。

表1 部分熱帶和亞熱帶地區(qū)食品和飼料樣品中AFB1的污染Table 1 AFB1 contamination in the food and feed samples from some tropical and subtropical zones

3 AFB1脫毒方法的比較

考慮到食品安全問題，許多國家和地區(qū)規(guī)定了食品和飼料中AFB1含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，國際上歐盟規(guī)定AF的限量標(biāo)準(zhǔn)范圍為4～15 μg·kg-1，AFB1的允許范圍為0.1～12 μg·kg-1，美國食品和藥品管理局將AFB1在食品中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為20 μg·kg-1[18]。各組織及國家關(guān)于食品中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)見表2[18-19]。

表2 各組織及國家食品中對黃曲霉毒素B1的限量Table 2 Limits of Aflatoxin B1 in the foods from various organizations and countries

目前去除AFB1的方法主要包括物理、化學(xué)和生物法，各脫毒方法各有其優(yōu)缺點，表3列出了AFB1常用的脫毒方法的比較。

表3 AFB1脫毒方法的比較Table 3 Comparison of AFB1 detoxification methods

3.1 物理脫毒

3.1.1吸附 吸附脫毒主要利用吸附劑吸附毒素來減少飼料以及農(nóng)副產(chǎn)品中毒素的含量，從而達(dá)到減毒效果，但不能降低毒素，無法徹底解決毒素污染問題。傳統(tǒng)的吸附劑包括硅膠、黏土、沸石、氧化鋁等，新型的吸附劑包括纖維素、殼聚糖及硅鋁酸鹽類等有機物。近年來，經(jīng)過不斷的探索，納米技術(shù)已應(yīng)用于吸附劑，如磁性吸附劑，其吸附容量和材料穩(wěn)定性已遠(yuǎn)遠(yuǎn)提高[36]。Pirouz等[37]利用磁性氧化石墨烯納米復(fù)合材料(MGO)的吸附作用來減少鐮刀屬真菌毒素的污染。對于新材料和新技術(shù)的探索在不斷增加，Scaglion等[20]采用22中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計，提出了使用稻殼作為吸附劑來去除AFB1，用0.5 g大小為42目的稻殼吸附10 mL被黃曲霉毒素B1和M1污染的牛奶，平均吸附量約為0.0150 μg·g-1AFB1和0.0174 μg·g-1AFM1，且吸附劑基本能達(dá)到100%回收率。吸附劑雖成本低，且能重復(fù)利用，但因其特殊的選擇性、可逆性以及不穩(wěn)定性，且反復(fù)洗脫可以使毒素游離出來，很少在工業(yè)化上應(yīng)用。

3.1.2輻射 輻射脫毒主要是利用紫外線、X射線、γ射線以及微波等手段殺滅微生物或破壞其產(chǎn)生的毒素分子結(jié)構(gòu)，從而減弱其毒性。最為常見的方法是紫外線輻射，通過破壞真菌的蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)，使其在代謝過程中發(fā)生紊亂，從而抑制產(chǎn)毒真菌的生長[38]，從根源上減少毒素的污染。Gillani等[17]先后用輻射、日照以及紫外線復(fù)合處理被真菌毒素污染的玉米，去除率幾乎達(dá)到100%。紫外線輻照對真菌毒素的去除效果良好，且?guī)缀醪粫茐氖称分械钠焚|(zhì)，在食品行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

γ射線是比較常見的輻射脫毒方法，F(xiàn)erreira-Castro等[39]用5 kGy劑量的γ射線能夠有效地抑制鐮刀屬真菌的生長，掃描電鏡結(jié)果顯示菌絲體受到輻射損傷，當(dāng)輻照劑量增加到10 kGy時，鐮刀菌毒素完全被降解。Chanem等[21]研究了γ 射線對食品和飼料中AFB1的影響，數(shù)據(jù)顯示，輻照劑量為10 kGy的γ射線對玉米、大麥中AFB1的去除率分別為84.23%和89.86%。Wang等[40]用Co60γ射線處理含20 μg·L-1AFB1的甲醇水溶液(60∶40，V甲醇∶V水)，用高效液相色譜-四極桿飛行時間光譜儀獲得20多種放射性產(chǎn)物的分子量和分子式，且提出了7種關(guān)鍵的放射性產(chǎn)物的可能形成途徑。γ射線雖脫毒效率高且能實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用，但高劑量的輻射可能會破壞食品質(zhì)感，同時存在一定的安全隱患，因此，其對處理過程環(huán)境要求十分嚴(yán)格。

3.1.3熱處理 熱處理脫毒主要是通過高溫破壞真菌毒素的分子結(jié)構(gòu)，達(dá)到減毒的目的。利用高溫脫毒是早期最常用的手段之一，其主要包括干燥、蒸煮、烘烤等。AFB1耐受溫度高于235℃，對高溫具有很強的抵抗力，因此簡單的加熱不能夠完全去除，然而延長加熱時間似乎能提高其去除率，如被AFB1污染的花生粕進(jìn)行焙烤30 min，對AFB1的去除率可達(dá)到40%～60%[22]；Lee等[23]用100℃和150℃處理被AFB1污染的大豆90 min，去除率分別為41.9%和81.2%，由此可見熱處理去除毒素的效率與溫度、加熱時間息息相關(guān)，同時毒素濃度和樣品含水量可能也會影響脫毒的效果。熱處理操作簡便，但高溫伴隨大量的熱量消耗，增加成本的投入，不適于工業(yè)化的應(yīng)用，同時高溫也會影響食品的品質(zhì)和口感，因此食品工業(yè)可能會將研究方向轉(zhuǎn)移到非熱處理技術(shù)上。

3.2 化學(xué)脫毒

化學(xué)法脫毒主要是利用添加的化學(xué)試劑修飾或破壞毒素的分子結(jié)構(gòu)從而達(dá)到脫毒，如O3、酸堿、氨氣等對真菌毒素有一定的破壞作用；同時化學(xué)脫毒法存在一定的缺陷，會導(dǎo)致化學(xué)物質(zhì)的二次污染，殘留的化學(xué)物質(zhì)可能直接威脅人們的健康。

3.2.1臭氧 O3作為強氧化劑，在水溶液中有極強的氧化分解能力。Luo等[41]研究表明O3能夠破壞AFB1終端的呋喃環(huán)雙鍵，進(jìn)而降低化合物的毒性，主要是通過-CH3、-OH、-CO等基團的丟失來脫毒。Mohammadi等[25]利用臭氧來降解牛奶中的AFM1，結(jié)果顯示，O3處理5 min能去除牛奶中50%AFM1，處理時間越長，去除效果越好，牛奶中的微生物總量和β-胡蘿卜素含量顯著下降，但pH和氧化水平?jīng)]有明顯變化，該文首次報道了臭氧處理牛奶中的AFM1污染問題。O3脫毒法操作簡單，且無毒物殘留，適用于食品脫毒，但其強氧化性破壞食品中的蛋白質(zhì)和維生素等成分，該方法不適用于對營養(yǎng)價值要求較高的食品脫毒。

3.2.2堿處理 在堿性條件下，AFB1的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)十分不穩(wěn)定，易發(fā)生水解，生成水溶性的無毒鈉鹽，AFB1結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而達(dá)到減毒的目的。張春華等[26]將受AFB1污染的花生原料浸泡在pH為8～9的堿性溶液中，AFB1的去除率可到達(dá)56.73%。同時楊威等[27]也報道用pH為13.40的堿液浸泡四級花生15 min，壓榨花生油中AFB1的脫毒效果達(dá)93.3%。除此之外，氨氣也可以降低其毒性，氨氣通過與AFB1發(fā)生脫-OH反應(yīng)，破壞其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，達(dá)到解毒目的。氨氣來源廣泛且能回收利用，具有較大的開發(fā)潛力。堿處理脫毒效率高，但堿容易與食品中的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，在一定程度上會影響食品的口感和品質(zhì)。

3.2.3天然產(chǎn)物 天然產(chǎn)物是一類由動物、植物、以及微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有廣泛的來源，因此在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥方面得到廣泛的應(yīng)用。近年，利用天然代謝產(chǎn)物來降解生物毒素的研究方向逐漸成為人們的聚焦點。

Anjum等[42]研究了薄荷葉及芽的水提取物對AFB1和AFB2的去除情況，葉提取物對AFB1(100 μg·L-1)和AFB2(50 μg·L-1)的降解率分別為75%、80%；芽提取物對其的降解率僅為40%～48%，通過LCMS/MS分析得到7種AFB1的降解產(chǎn)物，同時MS/MS光譜顯示大多數(shù)產(chǎn)物是由苯環(huán)側(cè)鏈甲氧基的丟失、呋喃環(huán)末端雙鍵的去除和內(nèi)酯基團的修飾形成，且降解產(chǎn)物對海水蝦表現(xiàn)出更低的毒性。Iram等[28]探究檸檬桉水提物對黃曲霉家族B1和B2的降解作用，在pH為8，30℃孵育72 h脫毒率分別為95.21%和92.95%。隨后研究了決明子葉水提取物對AFB1和AFB2的降解率分別為90.4%和88.6%[29]，通過MS/MS譜圖顯示降解產(chǎn)物主要通過末端呋喃環(huán)雙鍵的去除以及內(nèi)酯環(huán)的修飾形成?？偠灾?，天然產(chǎn)物的開發(fā)為真菌毒素降解的研究灌入了一個全新的思維。

3.3 生物脫毒

生物法脫毒是目前AFB1脫毒的研究熱點，其機制主要是利用細(xì)胞吸附、生物轉(zhuǎn)化以及分泌生物酶來減少毒素含量。目前報道能降解AFB1的微生物包括枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、乳酸桿菌Lactobacillusplantarum、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、嗜鹽念珠球菌Tetragenococcushalophilus、黑曲霉Aspergillusniger和平菇Pleurotusostreatus等。大多數(shù)降解菌株以香豆素作為唯一碳源篩選得到。部分微生物對AFB1的降解情況見表4。

表4 降解AFB1的部分微生物Table 4 Microorganisms partially degrading AFB1

3.3.1生物吸附 有研究表明微生物吸附去除AFB1主要是通過以非共價的方式形成菌體-AFB1復(fù)合物，從而來減少毒素的污染。目前，普遍認(rèn)為微生物吸附主要是與細(xì)胞壁中的肽聚糖及多糖分布有關(guān)。Li等[30]研究嗜鹽酵母菌CGMCC 3790(salt tolerantCandidaversatilisCGMCC 3790)對AFB1的降解機理和動力學(xué)，數(shù)據(jù)顯示菌體與20 ng·mL-1AFB1孵育1 h，對AFB1的吸附效率達(dá)69.40%。Li等[48]研究報道嗜鹽念珠球菌CGMCC 3792(salt tolerantTetragenococcushalophilusCGMCC 3792)通過生物吸附作用1 h可去除54.25% 的AFB1(20 ng·mL-1)。同時Kosztik等[31]研究乳酸桿菌對AFB1和雜色曲霉素(sterigmatocystin，ST)的吸附能力，其中乳酸桿菌Lactobacillus.PentosusTV3 10 min能吸附11.5% AFB1，但對ST吸附率卻高于20%，同一菌株對不同毒素的結(jié)合潛力存在明顯的差異，保守的肽聚糖結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致差異的關(guān)鍵原因。微生物吸附作用綠色安全，對毒素的去除具有一定的應(yīng)用前景。

3.3.2生物降解 1967年，Lillehoj等[52]首次報道橙色黃桿菌Flavobacteriumaurantiacum能夠降解黃曲霉毒素B1。多數(shù)微生物都是酶促生物轉(zhuǎn)化，通過溫和綠色環(huán)保的方法降低食品中的AFB1濃度。Xu 等[32]從43株細(xì)菌中分離篩選得到1株對AFB1降解效率高達(dá)92.1% 的沙克氏桿菌 L7(BacillusshackletoniiL7)，并從代謝產(chǎn)物中分離出分子量為22 kDa的胞外酶，該酶在70℃，pH為8.0表現(xiàn)出較高的活性。Wang 等[33]從白腐真菌YK-624(white-rot fungusPhanerochaetesordidaYK-624)中提取到錳過氧化物酶(MnP)，研究表明該酶能夠有效地降解AFB1，推測其降解機制：AFB1首先被MnP氧化成AFBO，隨后再水解成低毒的AFB1-8，9-二氫二醇，目前未見報道該酶的相關(guān)酶學(xué)常數(shù)Km及Kcat。Eshell等[53]報道在30℃，pH值為6.0的條件下紅曲霉與AFB1孵育24 h后，對AFB1的去除效率達(dá)到95.9%，同時通過HR-FTMS分析測試表明，AFB1的降解與脂肪酸代謝和糖酵解中間產(chǎn)物的積累有關(guān)，并從紅曲霉中鑒定出許多關(guān)于芳香族化合物的分解代謝途徑相關(guān)的酶。

3.4 其他脫毒技術(shù)

光催化作用已成功用于污水和有機物污染物的降解，其中二氧化鈦(TiO2)在光催化降解有機污染物方面具有很大的潛力，但可見光響應(yīng)差，光生電子-空穴對分離效率低，限制了其廣泛的應(yīng)用?？萍荚诓粩嗟剡M(jìn)步，Zhang等[35]通過原位溶劑熱法成功制備了TiO2/UiO-67光催化劑，80 min對AFB1的降解率為98.9%，效果優(yōu)于市售的P25、TiO2和大多數(shù)可見光照射下報道的光催化劑。光催化為環(huán)境中有機污染物的降解提供一個有效的策略。

4 展望

目前，關(guān)于AFB1的降解手段呈現(xiàn)多樣化，但隨著生物科技的發(fā)展，生物法脫毒因其高效安全、綠色環(huán)保的特點，將成為未來真菌毒素脫毒手段的聚焦點。因此，未來生物脫毒可朝著以下3個方向延伸：(1)抑制產(chǎn)毒真菌的生長；從根源上減少生物毒素的污染；(2)對生物毒素的生物合成途徑進(jìn)行調(diào)控，抑制產(chǎn)毒基因的表達(dá)；(3)人工過表達(dá)具有降解作用的生物酶。隨著降解酶逐漸被發(fā)現(xiàn)和研究，降解條件和效果也在不斷優(yōu)化，真菌毒素的研究將會有巨大的發(fā)展空間。此外，隨著合成生物學(xué)技術(shù)的成熟和基因編輯技術(shù)的發(fā)展，研究者們構(gòu)建出能夠表達(dá)高附營養(yǎng)價值的細(xì)胞工廠(如降解酶、藥物蛋白以及生物化學(xué)品等)；在食品、藥物和環(huán)境保護(hù)等方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ瑫r可通過基因編輯技術(shù)建立降解真菌毒素的專屬“細(xì)胞工廠”。

此外，關(guān)于真菌毒素的生物脫毒仍存在三方面問題：(1)難以篩選到具有高效降解作用的菌株，且實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用面臨巨大的挑戰(zhàn)；(2)生物脫毒技術(shù)不夠完善，對生物酶和活性分子的分離純化技術(shù)欠缺；(3)降解機制和降解產(chǎn)物的種類及其安全性研究較少。通過解決以上3個方面的問題，生物法降解AFB1才能有望在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用。