白 雪，王玲芝，余錦欣，章文賢

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350117)

牛樟芝Antrodiacamphorata素有“森林紅寶石”美譽(yù)，是一種產(chǎn)于我國臺灣地區(qū)的珍稀食藥用絲狀真菌。野生牛樟芝僅生長于中國臺灣山區(qū)海拔600～2 000 m特有樹種——牛樟樹Cinnamomumkanehirae的中空內(nèi)壁。牛樟芝提取物中有許多活性成分，主要包括三萜類化合物、苯酸類化合物、木脂素、多糖、超氧歧化酶、馬來酸和琥珀酸及其衍生物等[1-3]，其中牛樟芝中的三萜類化合物含量是普通靈芝的30倍以上[4-5],且未發(fā)現(xiàn)亞急性毒性和基因毒性，有極高的藥用價值[6-7]。近年來，牛樟芝在抗炎、保肝、抗癌和抗氧化等領(lǐng)域的研究成果均表明出極大的開發(fā)潛力[8-12]。但是，由于牛樟芝寄主專一性強(qiáng)、生長緩慢，早期不法濫采造成野生牛樟芝資源稀缺，致使市場價格居高不下，因此牛樟芝的人工栽培技術(shù)受到廣泛的關(guān)注。

目前牛樟芝人工培養(yǎng)方式主要包括椴木培養(yǎng)法、深層液體發(fā)酵培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法3種[13]。椴木培養(yǎng)雖然能獲得與野生牛樟芝中所含的活性物質(zhì)十分相似的牛樟芝子實(shí)體，但培養(yǎng)時間長達(dá)2～3年，生產(chǎn)成本較高，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。深層液體發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)周期短，但獲得的菌絲體中所含三萜類生理活性物質(zhì)成分較少，藥用價值和經(jīng)濟(jì)效益有限[14]。固體培養(yǎng)不因牛樟樹稀有而受到限制，其代謝產(chǎn)物種類與樟芝子實(shí)體相似，能獲得更多生理活性物質(zhì)，已成為主流的牛樟芝人工培養(yǎng)技術(shù)。固體培養(yǎng)可分為太空包固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)、皿式培養(yǎng)和錐形瓶培養(yǎng)3種。近年來皿式培養(yǎng)法由于總體培養(yǎng)時間較短、菌體易于基質(zhì)分離、質(zhì)控容易以及所得牛樟芝子實(shí)體中含有的活性成分與野生牛樟芝相似，已經(jīng)成為牛樟芝人工培養(yǎng)的最佳方式[15]。然而目前皿培均采用瓊脂培養(yǎng)基，將谷物置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行谷物皿培兼具基質(zhì)天然營養(yǎng)豐富和通風(fēng)良好的優(yōu)勢，有望得到生長迅速、活性成分產(chǎn)量高的牛樟芝。目前該培養(yǎng)方式尚未見報道。

本研究從野生牛樟芝子實(shí)體上分離得到菌株，經(jīng)過培養(yǎng)、鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析確定為牛樟芝后，再以生長速率和總?cè)坪繛橹笜?biāo)確定最佳牛樟芝谷物皿培基質(zhì)，為進(jìn)一步大規(guī)模培養(yǎng)牛樟芝及合成三萜類物質(zhì)，研究其藥用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

菌株由中國臺灣牛樟芝子實(shí)體分離得到，命名為BX1119.1。

1.2 儀器和試劑

HS-840超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GI54高壓滅菌鍋：上海富士工器有限公司；SPX-250B生化培養(yǎng)箱：上海力辰儀器科技有限公司；KQ-500E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器(上海)有限公司；DL9700 PCR擴(kuò)增儀：北京東林昌盛生物科技有限責(zé)任公司；Mini Gel電泳槽：美國Thermo Scientific；GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

PrimeSTAR HS (Premix)、DL2000 DNA Marker、Gold View核酸染料，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，引物合成由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基(w/v)：瓊脂2%，去離子水補(bǔ)齊，pH自然。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(w/v)：新鮮去皮土豆(煮汁)20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，去離子水補(bǔ)齊，pH自然。谷物皿式培養(yǎng)基：用研磨機(jī)分別研磨麩皮、黃米、莜麥、玉米、大米、蕎麥后過20目篩作為固態(tài)基質(zhì)保存?zhèn)溆谩；邴熎さ幕境煞郑詥嘻熎?、麩皮與5種碳源谷物基質(zhì)黃米粉、莜麥粉、玉米粉、大米粉、蕎麥粉按1∶1(w/w)分別組成6種培養(yǎng)基，依次編號為CK、A、B、C、D、E。高壓蒸氣滅菌：103.4 kPa、121℃、20 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1菌株分離 無菌手術(shù)刀切下牛樟木表面的牛樟芝子實(shí)體，75%乙醇中浸泡1 min后，無菌水清洗5次去除酒精殘留，滅菌濾紙吸干水分，接種至水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，1周后轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，待其長出菌絲后劃線分離，挑取單菌落保種。

1.4.2菌株鑒定 (1)形態(tài)學(xué)特征。牛樟芝菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，每日觀察其菌落形態(tài)。(2)rDNA ITS序列分析。按DNA試劑盒說明書步驟提取牛樟芝菌絲DNA，以SanTaqPlus PCR Mix試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)以牛樟芝基因組DNA為模板，以真菌通用引物序列：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)對菌株rDNA ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，體系內(nèi)含PrimeSTAR HS(Premix)12.5 μL、Rnase-freeWater9.5 μL、引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)、模板DNA 2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；54℃退火(引物與模板結(jié)合)30 s；72℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。收集產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收產(chǎn)物送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序分析。使用CodonCode Aligner 5軟件對測序峰圖進(jìn)行拼接校對，將所獲得的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析。(3)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。測序得到的ITS序列與NCBI上的牛樟芝序列比對后，從數(shù)據(jù)庫中選擇相似度評分最高的且序列全長接近待鑒定菌株長度的物種對應(yīng)的核酸序列，同時選取側(cè)耳科香菇屬的香菇(Lentinulaedodes)作為外類群，下載保存成FASTA格式。運(yùn)行MEGA軟件進(jìn)行多重序列比對，完成比對后，截齊兩端，選擇最大似然法(Maximum likelihood method,ML)，執(zhí)行參數(shù)為Bootstrap method，重復(fù)1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.4.3菌株的培養(yǎng) (1)斜面保種。接種環(huán)挑取平皿上的單菌落，劃線接種于PDA斜面。(2)牛樟芝平板培養(yǎng)。將保藏在PDA斜面試管中的牛樟芝用接種鏟接種表面積為1 cm2的菌塊于PDA培養(yǎng)皿正中間，28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。

1.4.4牛樟芝谷物皿培法 PDA平板培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)20 d后，使用直徑10 mm的滅菌打孔器在牛樟芝新生菌絲上打孔，轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基的中部，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.5牛樟芝生物量測定 采用干重法。將發(fā)酵后的菌體60℃烘干至恒重，研磨后過80目篩，收集菌粉并稱重記錄。

1.4.6牛樟芝生長速度測定 分別測量接種第5、8、11、14、17、20 d的菌絲生長直徑。

1.4.7齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用高氯酸-香草醛顯色法進(jìn)行測定。過程如下：準(zhǔn)確稱取10 mg齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇定容至25 mL，振蕩均勻。分別吸取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL到試管中，100℃水浴加熱揮發(fā)干溶劑，再向試管中加入0.3 mL現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，60℃恒溫水浴20 min,水浴結(jié)束后，立即冰浴冷卻試管內(nèi)混合液體，再向每個試管中加入5 mL冰醋酸稀釋后搖勻。在波長550 nm處，測定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。

1.4.8牛樟芝三萜總量測定 采用高氯酸-香草醛顯色法進(jìn)行測定。過程如下：稱0.1 g干菌粉于10 mL離心管中，加入5 mL95%乙醇水溶液，50℃恒溫水浴1 h后超聲90 min，過濾，取0.1 mL濾液于試管中，100℃水浴加熱揮發(fā)干溶劑，再加入0.3 mL現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，60℃恒溫水浴20 min后，冰浴冷卻，再向每支試管中加入5 mL冰醋酸稀釋后搖勻，檢測并記錄波長550 nm的吸光值。將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三萜類化合物的含量[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與作圖采用Excel 2003完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征分析

由圖1A可知，在PDA培養(yǎng)基上，初期菌絲為白色，后經(jīng)橘紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，菌絲茂密以輻射狀短分支向周圍延伸，菌落隆起，有一定厚度，且中間比邊緣厚。圖1B可知，背部呈黃色。有牛樟芝特有芳香氣味。本實(shí)驗(yàn)室分離到的菌株與賴敏男[15]提到的皿式培養(yǎng)法的牛樟芝形態(tài)相似。

圖1 BX1119.1樣品在PDA培養(yǎng)基上生長情況(A為正面，B為背面)Fig.1 Growth of the BX1119.1 samples on PDA culture substrate (A for the front, B for the back)

2.2 菌株ITS測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離到的牛樟芝ITS序列以通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，得到電泳條帶的大小約為680 bp，條帶清晰且無拖尾，無雜帶出現(xiàn)(圖2)，可進(jìn)行膠回收，產(chǎn)物送至北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序分析。

圖2 BX1119.1 ITS序列電泳結(jié)果Fig.2 Electropherogram of ITS sequence of BX1119.1

將測得的序列進(jìn)行Blast檢索比對，共篩選出10個序列(含1個外類群)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果表明，BX1119.1與Taiwanofunguscamphoratus(KP054990.1)序列同源性最高，相似度達(dá)到99.7%，聚類在同一支，表明為同種牛樟芝，分類地位為真菌界Eumycetes、擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌綱Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、薄孔菌屬Antrodia。

圖3 BX1119.1及其參考菌株的ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequences of BX1119.1 and its reference strains

2.3 不同谷物皿培基質(zhì)對牛樟芝的生長的影響

由于瓊脂塊表面的菌絲長到培養(yǎng)基表面需要一定時間，所以本試驗(yàn)從接種第5 d開始記錄數(shù)據(jù)。由圖4可知，接種第5 d時，CK和其余5組試驗(yàn)組均長出白色的初生菌絲，B(麩皮+莜麥粉)、C(麩皮+玉米粉)、D(麩皮+大米粉)菌絲致密，而A(麩皮+黃米粉)菌絲疏松；第8 d時CK(麩皮)菌落仍為白色，A(麩皮+黃米粉)為淺橘色，較疏松，其他4組均變?yōu)殚偌t色，菌落緊密；第14 d時，CK(麩皮)變成淺黃色，菌落很薄，A(麩皮+黃米粉)變成橘紅色，但與其他實(shí)驗(yàn)組顏色深淺不同；第20 d時，CK(麩皮)淺黃色程度加深，但仍然很薄，其他5組試驗(yàn)組均為橘紅色，菌落致密，顏色由深至淺為D(麩皮+大米粉)>C(麩皮+玉米粉)>B(麩皮+莜麥粉)>E(麩皮+蕎麥粉)>A(麩皮+黃米粉)。

圖4 牛樟芝菌株在不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)上的生長情況Fig.4 Growth of Antrodia camphorata strains on different grain culture substrates

由圖5可知，接種第5 d時，A(麩皮+黃米粉)菌絲直徑最大，B(麩皮+莜麥粉)和C(麩皮+玉米粉)直徑基本一致，E(麩皮+蕎麥粉)菌絲直徑最小。第8 d時，CK(麩皮)和E(麩皮+蕎麥粉)菌絲直徑接近，A(麩皮+黃米粉)菌絲直徑仍然最大。第11 d時，A(麩皮+黃米粉)直徑最大，生長速度是CK(麩皮)的2.5倍。第14 d時，A(麩皮+黃米粉)直徑最大，D(麩皮+大米粉)生長速度最快是CK(麩皮)的1.41倍。第17 d時，C(麩皮+玉米粉)生長速度變慢與D(麩皮+大米粉)直徑接近。第20 d時，A(麩皮+黃米粉)直徑最大且生長速度最快是A(麩皮)的2.64倍。

圖5 牛樟芝菌株在不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)上的生長速度Fig.5 Growth rate of Antrodia camphorata strains on different grain culture substrates

由圖6可知，在接種第20 d時，A(麩皮+黃米粉)干重最大，為(47.69 mg·g-1培養(yǎng)基質(zhì))，是CK(麩皮)的4.27倍。結(jié)合圖4可知，E(麩皮+蕎麥粉)比A(麩皮)菌落厚，所以在E(麩皮+蕎麥粉)的直徑比CK(麩皮)小的情況下，E(麩皮+蕎麥粉)的干重仍然比對照組CK(麩皮)大。

圖6 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對牛樟芝菌絲體生物量的影響Fig.6 Effects of different grain culture substrates on the mycelial biomass of Antrodia camphorata

2.4 不同固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)對牛樟芝三萜合成的影響

由圖7A可知，在接種第20 d時，B(麩皮+莜麥粉)的三萜含量最大(2.89 mg·dg-1干重)，CK(麩皮)的最小(0.89 mg·dg-1干重)。B(麩皮+莜麥粉)的三萜含量是E(麩皮+蕎麥粉)的1.45 倍，是CK(麩皮)的3.21 倍。A(麩皮+黃米粉)直徑最大，但三萜含量比B(麩皮+莜麥粉)低(0.13 mg·dg-1干重)。由圖7B可知，在接種第20 d時，A(麩皮+黃米粉)的三萜產(chǎn)量最高達(dá)到(1.315 mg·g-1谷物培養(yǎng)基質(zhì))，是對照組CK(麩皮)的13倍。雖然B(麩皮+莜麥粉)三萜含量比A(麩皮+黃米粉)高，由于A(麩皮+黃米粉)干重比B(麩皮+莜麥粉)大得多，所以A(麩皮+黃米粉)的產(chǎn)量最高，且是B(麩皮+莜麥粉)的1.55倍。

注：A為不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲體三萜含量的影響；B為不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲體三萜產(chǎn)量的影響圖7 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對牛樟芝菌株三萜合成的影響Fig.7 Effects of different gain culture substrates on the biosynthesis of triterpenes in the strains of Antrodia camphorata

3 討論

本研究在菌種鑒定過程中，分離得到1種菌株，命名為BX1119.1，結(jié)合形態(tài)特征和ITS測序，確定該菌種為牛樟芝。采用谷物皿式培養(yǎng)法培育牛樟芝，探究了以麩皮為基本成分與其他5種不同谷物為輔料組合配方的固體基質(zhì)對牛樟芝菌絲體生長情況、生物量和三萜化合物合成的影響。牛樟芝在以麩皮為基本成分、不同輔料配方的固體培養(yǎng)基上均能生長出形態(tài)基本相似的菌絲，然而生長速度和干重有較大差異。在麩皮與黃米粉基質(zhì)中生長菌絲干重最大，與瓊脂皿培法中牛樟芝菌絲干重最適碳源山梨醇相比，是它的4.25倍，生長速度是它的1.54倍[18]。三萜類化合物作為牛樟芝的主要生理活性物質(zhì)，在不同谷物基質(zhì)培養(yǎng)基中測得的含量也明顯不同。本試驗(yàn)麩皮與莜麥粉做培養(yǎng)基質(zhì)時三萜含量最高，為(2.758±0.04)mg·dg-1DW，是使用大豆殼錐形瓶固態(tài)發(fā)酵牛樟芝的3.45倍[19]。數(shù)據(jù)表明，谷物皿培法相較傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法確實(shí)有一定的優(yōu)勢。與錐形瓶固態(tài)培養(yǎng)相比，谷物皿培通風(fēng)良好，基質(zhì)天然，且黃米粉中鉀含量較高、莜麥粉中蛋白質(zhì)和硫胺素含量較高，推測以上原因共同促進(jìn)了牛樟芝菌絲生長和三萜化合物的高效合成。

本研究旨在通過對牛樟芝人工培養(yǎng)條件中固態(tài)基質(zhì)配方的探索，獲得能替代昂貴牛樟芝子實(shí)體的新型谷物皿式培養(yǎng)物質(zhì)。從結(jié)果來看，利用麩皮與黃米粉按比例混合的固體培養(yǎng)基，顏色接近野生子實(shí)體，且三萜類物質(zhì)產(chǎn)量高。后續(xù)可通過優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)一步提高三萜產(chǎn)量，為牛樟芝的應(yīng)用提供參考。