齊慧慧，盧玉棟，章文賢*

(1.福建師范大學生命科學學院， 福建 福州 350007； 2.福建師范大學化學與材料學院， 福建 福州 350007)

靈芝Ganodermalucidum是一種藥食兩用真菌，富含多糖、三萜、核苷和甾醇等生理活性物質，其中三萜類化合物具有抗腫瘤、保肝、抗菌、抗炎癥、降低血糖血脂、抗氧化[1-3]等功效，靈芝酸作為最具代表性的三萜化合物在藥用及功能食品領域具有廣闊的應用前景。目前，靈芝酸生產大部分源于靈芝發(fā)酵，產量不能滿足人們的需要，因此提高靈芝酸產量的研究成為靈芝研究領域的熱點。

近年來有研究表明，靈芝生長和靈芝酸的代謝受中藥及其提取物、金屬離子、真菌激發(fā)因子和稀土元素等的影響[4-6]。朱強等[7]在靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加甘草、山茱萸等中藥，發(fā)現甘草更利于促進靈芝酸的合成，山茱萸同時促進靈芝生長和靈芝多糖合成。鮑銳[8]在靈芝培養(yǎng)過程中分別添加硫酸銅和氯化鈣，將靈芝酸產量提高了57%和29%。高興喜等[9]以木素木霉、蘑菇輪枝孢和頂頭孢為激發(fā)子菌株，采用脫脂脫蛋白酸解法制備真菌激發(fā)子，發(fā)現在發(fā)酵初期添加頂頭孢激發(fā)子可將靈芝酸產量提高5.2倍，在發(fā)酵后期添加木素木霉激發(fā)子可將靈芝酸產量提高4.0倍。

目前在靈芝培養(yǎng)過程中添加生物質的研究較少，尚未報道過在靈芝培養(yǎng)基中添加油茶籽殼的研究。另有研究表明，油茶籽殼作為碳源能夠促進茶樹菇、平菇和杏鮑菇的菌絲體生長[10]。此外，多種外源添加物對靈芝酸代謝都有顯著影響。因此本研究在靈芝液體發(fā)酵過程中添加不同濃度的油茶籽殼提取液，探究油茶籽殼提取液在靈芝液體靜置培養(yǎng)過程中對靈芝菌絲生長以及靈芝酸代謝的影響，以期為油茶籽殼的高價值化和靈芝液體靜置培養(yǎng)提供借鑒和技術參考。

1 材料與方法

1.1 菌種和材料

靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst，由福建師范大學國家教育部工業(yè)微生物研究工程中心保藏提供。

油茶籽殼均來自福建省永泰縣山茶油加工廠，選用新鮮干燥，無霉變無蟲蛀的油茶籽殼，經過預處理粉碎成長寬厚為(0.3～0.6)cm×(0.3～0.6)cm×(0.1～0.15)cm的顆粒。

1.2 培養(yǎng)基質

(1)PDA固體培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3.0 g，去離子水1 L，維生素 B10.05 g，pH為6.0。(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖35 g，蛋白胨5.0 g，酵母精粉2.5 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，維生素 B10.05 g，pH為6.0。(3)深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35 g，蛋白胨5.0 g，酵母精粉5.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，維生素 B10.05 g，pH為6.0。(4)油茶籽殼深層液體發(fā)酵培養(yǎng)基：以基礎深層培養(yǎng)基(不添加油茶籽殼提取液)為對照，油茶籽殼提取液原液在培養(yǎng)基中的配比分別設置為10%、20%、50%和100%。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1油茶籽殼提取液制備 將預處理后的油茶籽殼用破碎機打成粉末，過60目篩，油茶籽殼粉與蒸餾水1∶9的比例煮沸30 min，紗布過濾制成油茶籽殼提取液原液。

1.3.2斜面培養(yǎng) 用接種鏟將保藏在PDA試管中的靈芝菌絲切下一小塊放入新配制的PDA斜面的試管中，30℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長滿斜面。

1.3.3種子液體培養(yǎng) 在PDA斜面試管中加入10 mL無菌水，用接種鏟刮下白色菌絲體倒入種子培養(yǎng)基中。在30℃恒溫搖床內培養(yǎng)4 d，轉速為120 r·min-1。

1.3.4液體深層發(fā)酵培養(yǎng) 吸取20 mL靈芝菌絲接入深層發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種濃度設置3組平行。在30℃恒溫搖床內培養(yǎng)4 d，轉速為120 r·min-1。

1.3.5液體靜置培養(yǎng) 搖瓶培養(yǎng)4 d后，轉移到平板中，每個平板接入25 mL，30 ℃恒溫暗培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)結束時，將上層白色菌絲體取出，蒸餾水沖洗背面，收集備用。

1.4 測定方法

1.4.1靈芝菌絲體生物量的測定 將液體靜置培養(yǎng)收集的上層白色菌絲體，放置于平板中，50℃烘干至恒重后稱重。再在研缽中充分研磨成粉末，裝在 5 mL的離心管中保存在 4℃的冰箱中備用。

1.4.2發(fā)酵液中殘?zhí)呛康臏y定 將發(fā)酵液離心取上清液，稀釋適當倍數，利用葡萄糖氧化酶作為催化劑反應的原理，利用葡萄糖生物傳感分析儀測定氧含量變化，由此得到葡萄糖的濃度。

1.4.3總靈芝酸含量的測定 因齊墩果酸和靈芝酸都是三萜類化合物，且化學結構相似，因此用齊墩果酸來繪制總靈芝酸的標準曲線，檢測方法采用高氯酸-香草醛顯色法[11]。

1.4.4靈芝酸單體的測定 樣品前處理，稱取1.4.1步驟得到的靈芝菌絲體粉末100 mg，于2 mL的離心管中，加入1 mL70%乙醇，超聲處理30 min，靜置30 min，重復3次，離心收集上清液；重復上述步驟，將3次離心收集到的上清液烘干。將烘干后的樣品用1 mL色譜級甲醇溶解，再用0.22 μm的有機相濾膜過濾到樣品瓶中。用高效液相色譜檢測靈芝酸單體。HPLC檢測條件為:HPLC色譜柱為C18柱 ( Kromasil 100-5-C8，4.6×250 mm，5μm);進樣量20 μL;流速1 mL·min-1;流動相A為甲醇/乙酸(100∶0.5=V∶V)，流動相B為超純水;0～20 min，A相為80%～100%，B相為0～20%梯度洗脫;20～30 min，A相為100%，B相為0洗脫;紫外檢測波長為245 nm;柱溫為30℃;洗脫時間為30 min。記錄相應的峰面積和出峰時間。計算出各個靈芝酸單體的含量。

2 結果與分析

2.1 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體生長形態(tài)的影響

由圖1可知，添加10%和20%油茶籽殼提取液靈芝菌絲直徑始終大于對照組，添加50%和100%的則小于對照組。這表明低濃度油茶籽殼提取液有利于靈芝菌絲擴張，高濃度油茶籽殼提取液會抑制靈芝菌絲的向外生長，但高濃度的油茶籽殼提取液促使菌絲生長更加密壯。

圖1 油茶籽殼對靈芝菌絲體生長形態(tài)的影響Fig.1 Effect of camellia seed shell on the growth morphology of Ganoderma lucidum mycelia

2.2 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體生物量的影響

從圖2可知，靈芝菌絲體生物量從靜置培養(yǎng)開始隨時間不斷增加，前6 d生物量增加較快，從第6 d之后進入緩慢生長期，生物量積累較慢。在第6 d，對照組菌絲體生物量為16.7 g·L-1，添加10%、20%和50%油茶籽殼提取液的分別達到了19.2、21.3和16.5 g·L-1，添加100%油茶籽殼提取液為13.3 g·L-1，表明添加100%油茶籽殼提取液對菌絲體的生長有明顯抑制作用，添加低濃度的油茶籽殼提取液對菌絲體生長具有一定促進作用。

圖2 油茶籽殼對靈芝菌絲體生物量的影響Fig.2 Effect of camellia seed shell on the biomass of Ganoderma lucidum mycelia

2.3 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體發(fā)酵液中殘?zhí)呛康挠绊?/h3>

由圖3可知，靈芝菌絲體發(fā)酵液中葡萄糖含量隨著時間的增加逐漸減少，前6 d的葡萄糖消耗速度較快，在第9 d基本耗盡。從整體趨勢分析，添加不同濃度的油茶籽殼提取液能夠不同程度地提升靈芝菌絲體對葡萄糖的利用能力。

圖3 油茶籽殼提取液對葡萄糖消耗的影響Fig.3 Effect of camellia seed shell extract on the glucose consumption

2.4 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體總靈芝酸含量和產量的影響

由圖4A可知，添加20%、50%、100%油茶籽殼提取液的總靈芝酸含量在第9 d達到最高，分別為5.11、6.64和7.97 mg·dg-1，是對照組的1.29、1.67和2.01倍，而添加10%油茶籽殼提取液的靈芝酸含量只有對照的93%。可見高濃度油茶籽殼提取液對靈芝酸的積累有促進作用。由圖4B可知，添加10%和20%油茶籽殼提取液的總靈芝酸產量略低于對照組。而50%和100%油茶籽殼提取液使總靈芝酸產量達到了1 406.37和1 599.73 mg·L-1，分別為對照組的1.34和1.52倍。

注：A為總靈芝酸含量；B為總靈芝酸產量圖4 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體總靈芝酸含量的影響Fig.4 Effect of camellia seed shell extract on the total content of ganoderic acid in Ganoderma lucidum mycelia

2.5 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體4種靈芝酸單體含量的影響

由圖5可知，靈芝菌絲體4種靈芝酸單體的合成在高濃度提取液下都表現出了促進作用：添加50%油茶籽殼提取液的靈芝酸單體GA-Mk、GA-T、GA-S 和GA-Me含量在第9 d分別達到505.973、604.133、369.268和255.967 ug·dg-1，相較于對照組，分別提高了的16.05%、5.5%、32.5%和67.1%。添加100%油茶籽殼提取液的靈芝酸單體GA-Mk、GA-T、GA-S 和GA-Me含量在第9 d分別達到557.327、599.355、418.773和274.443 ug·dg-1，相較于對照組，分別提高了的27.83%、4.7%、50.3%和79.2%?？梢娫谳^高濃度范圍內，4種靈芝酸單體的含量隨著油茶籽殼提取液濃度的增高而增高。

圖5 油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體靈芝酸單體含量的影響Fig.5 Effect of camellia seed shell extract on the content of ganoderic acid monomer in Ganoderma lucidum mycelia

3 結論與討論

油茶籽殼作為常見的廢棄生物質材料之一，其中包含粗蛋白、纖維素、半纖維素、木質素、還原糖、粗脂肪和灰分等多種成分[12]，將其高價值化對環(huán)境保護和能源高效利用都具有意義。因此，本試驗用不同濃度油茶籽殼提取液對靈芝進行液體靜置培養(yǎng)，結果表明，添加高濃度的油茶籽殼提取液對靈芝的生長具有一定抑制作用，較低濃度的油茶籽殼提取液對靈芝的生長有一定促進作用。靈芝菌絲體發(fā)酵液的pH隨著發(fā)酵過程不斷降低，油茶籽殼提取液的添加并無影響。添加50%和100%濃度油茶籽殼提取液對靈芝菌絲體總靈芝酸含量和產量均有明顯提升作用，相較于對照組，它們的含量分別提升了67%和101%，產量分別提升了34%和52%。4種靈芝酸單體GA-Mk、GA-S、GA-T和GA-Me的生成同樣受到高濃度油茶籽殼提取液的促進，100%濃度的油茶籽殼提取液將靈芝酸單體GA-S和GA-Me的含量都提高了50%以上；而低濃度的油茶籽殼提取液(10%和20%濃度)則具有相反的抑制作用。

此前有研究報道，油茶籽殼中還含有總黃酮、花青素、多糖、茶皂素、木糖醇等物質[12]。在其他食用菌中如猴頭菇，香菇，小白菇和黑木耳等食用菌中都發(fā)現一定濃度的茶皂素對其菌絲生長有顯著的抑制作用[13-14]，由此推斷高濃度提取液條件下的生長抑制或許是由茶皂素導致的。靈芝酸的代謝往往受逆境因素的影響，油茶籽殼中的抑菌因子可能反而誘導靈芝酸的合成。另據裴海生等[15]的研究，木質素作為營養(yǎng)基質培養(yǎng)的靈芝多糖含量和總三萜含量均有提高，油茶籽殼中的木質素也可能是本研究中靈芝酸含量提高的原因。由此可見，油茶籽殼作為靈芝的培養(yǎng)基質具有一定應用價值，同時也是提高靈芝酸產量的一種有效方法。