邢亞芹，馮荊城，黃煒雅，高媛媛

(細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點實驗室/福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

弧菌是造成水產(chǎn)品細(xì)菌感染性疾病的主要原因之一，其中創(chuàng)傷弧菌是常見的危害較大的一種致病弧菌[1]，其可引發(fā)多種水產(chǎn)動物患病，導(dǎo)致水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。感染者由于誤食和接觸感染創(chuàng)傷弧菌，往往發(fā)病急、病情重[2]，該菌致死率可高達(dá)50%以上，是致死率最高的海洋致病弧菌[3-4]。長期以來漁業(yè)生產(chǎn)中抗生素等藥物的使用，會引發(fā)創(chuàng)傷弧菌耐藥性問題[5]。我國多省市水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌均有較高檢出率，且多重耐藥頻發(fā)[6-9]。耐藥創(chuàng)傷弧菌常使某些藥物失效，臨床治療變得更加困難。

若不積極采取手段控制，創(chuàng)傷弧菌等水產(chǎn)病原菌的耐藥現(xiàn)象會愈演愈烈，逐漸構(gòu)成嚴(yán)重威脅。為了解決創(chuàng)傷弧菌等水產(chǎn)病原菌的耐藥性問題，目前相關(guān)研究主要從以下方面展開：一是開發(fā)新的藥物來替代現(xiàn)有抗生素，如抗菌肽。有學(xué)者開發(fā)了一種多肽，對創(chuàng)傷弧菌有很好的殺菌效果[10]；也有研究從鏈霉菌發(fā)酵物中提取的抗菌肽對創(chuàng)傷弧菌有抗菌作用[11]。但目前抗菌肽在應(yīng)用上存在一定的弊端，比如：穩(wěn)定性差，合成或提取成本高，作用機(jī)制并不是特別清楚等[12]。二是創(chuàng)傷弧菌相關(guān)疫苗的開發(fā)，最新進(jìn)展停留在莢膜四糖重復(fù)片段的合成及相關(guān)糖蛋白免疫活性研究[13-14]，實際應(yīng)用還需要較長的周期。此外，通過一些物理方法如快速冷凍[15]、加熱[16]，或者化學(xué)方法如外源添加佐劑(例如正丁醇[17]、1,2-丁二醇[18]、5-甲基吲哚[19]等)的方式來增強(qiáng)現(xiàn)有抗生素的殺菌效果，也是目前減少細(xì)菌耐藥性的有效途徑。但這些研究尚未涉及水產(chǎn)病原菌。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，低離子休克(指環(huán)境中離子數(shù)量很少，物質(zhì)主要為分子形式存在，例如超純水介質(zhì))可以增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素對嗜水氣單胞菌等水產(chǎn)病原菌的殺滅效果，且慶大霉素在低離子條件下可以快速有效殺滅斑馬魚皮膚感染模型中的嗜水氣單胞菌[20]。與對數(shù)期細(xì)菌相比，平臺期細(xì)菌由于生長代謝緩慢，對抗生素更加耐受[21]。本試驗擬探討低離子休克是否可以促進(jìn)氨基糖苷類抗生素快速殺滅平臺期創(chuàng)傷弧菌。

氨基糖苷類抗生素因具有良好的抗菌活性，所以被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)、畜牧等行業(yè)[22]。本試驗首先測試平臺期創(chuàng)傷弧菌的敏感性，發(fā)現(xiàn)4種氨基糖苷類抗生素處理菌液2 h后難以殺滅。初步研究發(fā)現(xiàn)，介質(zhì)為可提供低離子環(huán)境的超純水時，可提高4種氨基糖苷類抗生素對創(chuàng)傷弧菌的殺滅效果；為探究低離子環(huán)境適宜的殺菌條件，設(shè)置了不同的抗生素處理濃度和時間，以確定其殺菌效果是否會受到濃度和時間的影響；為確定低離子促進(jìn)殺菌是否與抗生素攝取有關(guān)，測定低離子處理組和生理滲透壓對照組創(chuàng)傷弧菌對抗生素攝取量，以確定殺菌機(jī)制是否為增加抗生素的攝取。此研究從表型到機(jī)制的縱向思路，擬為生產(chǎn)、生活中創(chuàng)傷弧菌的殺滅提供新策略，期望有助于遏制創(chuàng)傷弧菌耐藥現(xiàn)象的進(jìn)一步惡化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗室保藏的創(chuàng)傷弧菌Vibriovulnificu、大腸桿菌Escherichiacoli。

1.2 試劑與溶液

培養(yǎng)基：含3%NaCl的LB液體培養(yǎng)基(1 L蒸餾水中：10 g蛋白胨、30 g氯化鈉、5 g酵母粉)，3%NaCl的LB固體培養(yǎng)基(1 L蒸餾水中：10 g蛋白胨、30 g氯化鈉、5 g酵母粉，15 g瓊脂)。含1%NaCl的LB液體培養(yǎng)基(1 L蒸餾水中：10 g蛋白胨、10 g氯化鈉、5 g酵母粉)，1%NaCl的LB固體培養(yǎng)基(1 L蒸餾水中：10 g蛋白胨、10 g氯化鈉、5 g酵母粉，15 g瓊脂)。緩沖液：0.01 mol·L-1PBS溶液(1 L蒸餾水中：8 g氯化鈉、0.2 g氯化鉀、1.44 g磷酸氫二鈉、0.24 g磷酸二氫鈉)、3%NaCl、超純水，上述溶液均經(jīng)過高壓滅菌鍋121℃，20 min高壓蒸汽滅菌。LB固體培養(yǎng)基滅菌完成后，倒入一次性無菌培養(yǎng)皿中待其凝固。4種氨基糖苷類抗生素儲液：慶大霉素(Genta)：25 mg·mL-1、妥布霉(Tob)：25 mg·mL-1、新霉素(Neo)：50 mg·mL-1、鏈霉素(Strep)：100 mg·mL-1。用滅過菌的超純水加粉末狀固體藥物進(jìn)行配置，后用0.22 μm濾膜過濾以除去雜菌，-20℃冰箱儲存。裂解液：100 mg·mL-1溶菌酶： 30 mmol·L-1Tris-HCl混合 1 mmol·L-1EDTA-Na2緩沖液(pH=8)配置。

1.3 4種氨基糖苷類抗生素對平臺期創(chuàng)傷弧菌處理后敏感性測試

取-80℃冰箱中20%甘油保存的菌種，1∶1 000接種至3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h。過夜活化的細(xì)菌取40 μL至20 mL3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h至平臺期。吸取菌液100 μL至1.5 mL圓EP管中，加入4種氨基糖苷類抗生素溶液至相應(yīng)的濃度，慶大霉素和妥布霉素為100 μg·mL-1，鏈霉素和新霉素為500 μg·mL-1。后置于30℃、220 r·min-1搖床中處理2 h，對照組不加抗生素。13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入200 μL 0.01 mol·L-1PBS，重懸后靜置5 min以洗掉殘留的抗生素。再次13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入100 μL 0.01 mol·L-1PBS重懸。每次稀釋10倍，稀釋5次，每次取4 μL加至3%LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)12 h，掃描儀掃描獲取圖像，并統(tǒng)計3次獨立試驗細(xì)菌存活情況。

1.4 不同濃度的氨基糖苷類抗生素對創(chuàng)傷弧菌殺滅效果的測試

取-80℃冰箱中20%甘油保存的創(chuàng)傷弧菌菌種，1∶1 000接種至20 mL3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h。過夜活化的細(xì)菌取40 μL接菌至20 mL3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h至平臺期。吸取菌液100 μL至1.5 mL圓EP管中，13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清。加入4種氨基糖苷類抗生素的超純水溶液和生理等滲3%NaCl溶液重懸菌體，慶大霉素和妥布霉素濃度均為25 、50、100、200 μg·mL-1，鏈霉素和新霉素濃度均為25、50、100、200、500 μg·mL-1，處理時間5 min。接著13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入200 μL 0.01 mol·L-1PBS，重懸后靜置5 min以洗掉殘留的抗生素。再次13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入100 μL 0.01 mol·L-1PBS重懸。每次稀釋10倍，稀釋5次，每次取4 μL加至3%LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)12 h，掃描儀掃描獲取圖像，并統(tǒng)計3次獨立試驗細(xì)菌存活情況。

1.5 氨基糖苷類抗生素不同處理時間對創(chuàng)傷弧菌殺滅效果的測試

取-80℃冰箱中20%甘油保存的菌種，1∶1 000接種至20 mL3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃，220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h。過夜活化的細(xì)菌取40 μL接菌至20 mL3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h至平臺期。吸取菌液100 μL至1.5 mL圓EP管中，13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清。加入4種氨基糖苷類抗生素的超純水溶液和生理滲透壓的3%NaCl溶液重懸菌體，慶大霉素和妥布霉素為100 μg·mL-1，鏈霉素和新霉素為500 μg·mL-1，處理時間為1、3、5、10 min。13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入200 μL0.01 mol·L-1PBS，重懸后靜置5 min以洗掉殘留的抗生素。再次13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入100 μL0.01 mol·L-1PBS重懸。每次稀釋10倍，稀釋5次，每次取4 μL加至3%LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)12 h，掃描儀掃描獲取圖像，并統(tǒng)計3次獨立試驗細(xì)菌存活情況。

1.6 創(chuàng)傷弧菌對氨基糖苷類抗生素攝取量測定

選擇妥布霉素作為試驗中4種氨基糖苷類抗生素的代表，檢測處理后樣品中妥布霉素攝取量。取-80℃冰箱中20%甘油保存的菌種，1∶1 000接種至20 mL 3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h。過夜活化的細(xì)菌取40 μL接菌至20 mL3%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h至平臺期。

取大腸桿菌-80℃冰箱中20%甘油保存的大腸桿菌菌種，1∶1 000接種至1 mL 1%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)18 h。過夜活化的細(xì)菌取30 μL接菌至3 mL1%NaCl LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r·min-1搖床中培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4。后吸取30 μL菌液加至1 mLPBS中，均勻涂抹于LB方形皿表面，于超凈臺吹干。

樣品的制備：吸取平臺期創(chuàng)傷弧菌菌液1 mL至1.5 mL圓EP管中，13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清。加入100 μg·mL-1和200 μg·mL-1妥布霉素的超純水溶液和生理等滲3%NaCl溶液重懸菌體，處理時間為5 min。13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入1 mL 0.01 mol·L-1PBS，重懸后靜置5 min以洗掉殘留的抗生素。洗滌2次。再次13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入1 mL 0.01 mol·L-1PBS重懸。13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清，加入100 μL的終濃度為2 mg·mL-1溶菌酶，37℃、220 r·min-1搖床裂解2.5 h。裂解后，-80℃冰箱中冰凍4 min，共3次，每次凍完于常溫水化凍。90℃加熱10 min，13 000 r·min-1離心2 min，小心吸取上清獲得低離子處理組和生理滲透壓對照組的樣品。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：吸取平臺期創(chuàng)傷弧菌菌液1 mL至1.5 mL圓EP管中，13 000 r·min-1離心2 min，棄去上清。加入100 μL的2 mg·mL-1溶菌酶溶液，配置成妥布霉素濃度為0、20、40、60、80、100 μg·mL-1的溶液重懸菌體，37℃、220 r·min-1搖床裂解2.5 h。裂解后，-80℃冰箱中冰凍4 min，共3次，每次凍完于常溫水化凍。90℃加熱10 min，13 000 r·min-1離心2 min，吸取上清，獲得標(biāo)準(zhǔn)品。

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別取5 μL點在涂有大腸桿菌的方形皿中，每組3個平行。37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)12 h。掃描后得到圖5結(jié)果，通過測定圖5中標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈直徑大小，得到抗生素攝取量與抑菌圈線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。代入測定樣品抑菌圈直徑大小，計算出低離子處理組和生理滲透壓對照組抗生素攝取量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Excel單因素方差分析并作圖，數(shù)據(jù)取自3次獨立試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種氨基糖苷類抗生素對平臺期創(chuàng)傷弧菌處理后敏感性測試結(jié)果

由圖1可知，經(jīng)過4種抗生素2 h的處理，與對照組相比，4種抗生素中慶大霉素、妥布霉素、新霉素對平臺期創(chuàng)傷弧菌幾乎沒有殺滅效果，而鏈霉素僅僅殺滅1個數(shù)量級左右，說明平臺期創(chuàng)傷弧菌對氨基糖苷類抗生素比較耐受。

圖1 4種氨基糖苷類抗生素對平臺期創(chuàng)傷弧菌處理后敏感性測試結(jié)果Fig.1 Test results of the sensitivity of Vibrio vulnificus at the plateau phase after treated with four kinds of aminoglycoside antibiotics

2.2 不同濃度的氨基糖苷類抗生素對創(chuàng)傷弧菌殺滅效果的測試結(jié)果

由圖2可知，與創(chuàng)傷弧菌的生理滲透壓環(huán)境相比，處理時間為5 min時，低離子環(huán)境會促進(jìn)氨基糖苷類抗生素殺滅創(chuàng)傷弧菌，在慶大霉素和妥布霉素濃度為100 μg·mL-1時，能夠殺滅3～5個數(shù)量級的細(xì)菌，隨著濃度增加，殺滅效果增強(qiáng)，在濃度200 μg·mL-1時，能殺滅4～9個數(shù)量級的細(xì)菌，即殺滅99.99%及以上的細(xì)菌。在鏈霉素和新霉素濃度為200 μg·mL-1時，能夠殺滅2～3個數(shù)量級的細(xì)菌，隨著濃度增加，殺滅效果也增強(qiáng)，在濃度為500 μg·mL-1時可以殺滅3個數(shù)量級以上的細(xì)菌，即可以殺滅99.9%及以上的細(xì)菌。結(jié)果說明低離子處理促進(jìn)多種氨基糖苷類抗生素殺滅平臺期創(chuàng)傷弧菌都呈現(xiàn)一定的抗生素濃度依賴效應(yīng)。

圖2 不同濃度的氨基糖苷類抗生素對創(chuàng)傷弧菌殺滅效果的測試結(jié)果Fig.2 Measurement results of the killing efficacy of different concentrations of aminoglycoside antibiotics against Vibrio vulnificus

2.3 氨基糖苷類抗生素不同處理時間對創(chuàng)傷弧菌殺滅效果的測試結(jié)果

由圖3可知，與創(chuàng)傷弧菌的生理滲透壓環(huán)境相比，低離子環(huán)境會促進(jìn)氨基糖苷類抗生素殺滅創(chuàng)傷弧菌，在慶大霉素和妥布霉素濃度為100 μg·mL-1，鏈霉素和新霉素濃度為500 μg·mL-1時，處理1 min，能夠殺滅2～4個數(shù)量級的細(xì)菌，即99%及以上的細(xì)菌，隨著時間增加，殺滅效果也逐漸增強(qiáng)。在3 min時能夠殺滅3～5個數(shù)量級的細(xì)菌，即99.9%及以上的細(xì)菌。但是，慶大霉素處理組在延長至10 min時低離子促進(jìn)殺菌效果會變差。結(jié)果說明低離子處理促進(jìn)多種氨基糖苷類抗生素殺滅平臺期創(chuàng)傷弧菌亦呈現(xiàn)一定的時間依賴效應(yīng)。

圖3 氨基糖苷類抗生素不同處理時間對創(chuàng)傷弧菌殺滅效果的測試結(jié)果Fig.3 Measurement results of the killing efficacy of aminoglycoside antibiotics against Vibrio vulnificus at different treatment time

2.4 創(chuàng)傷弧菌對氨基糖苷類抗生素攝取量測定結(jié)果

由圖4、5可知，與生理滲透壓對照組相比，低離子休克處理組妥布霉素攝取量顯著增加。在妥布霉素濃度為100、200 μg·mL-1時，低離子環(huán)境下，妥布霉素的攝取量高于生理滲透壓NaCl對照組，差異極顯著。而且，隨著兩種介質(zhì)中抗生素濃度的增加，抗生素攝取量也呈現(xiàn)增加的趨勢。結(jié)果表明，低離子環(huán)境增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素殺菌效果的機(jī)制是促進(jìn)了創(chuàng)傷弧菌對抗生素的攝取。

圖4 創(chuàng)傷弧菌對氨基糖苷類抗生素攝取量測定結(jié)果Fig.4 Determination results of the intake of aminoglycoside antibiotics by Vibrio vulnificus

圖5 創(chuàng)傷弧菌抑菌圈結(jié)果(妥布霉素)Fig.5 Results of the bacteriostatic ring of Vibrio vulnificus (tobramycin)

3 結(jié)論與討論

之前有研究表明低離子休克可以增加氨基糖苷類抗生素對細(xì)菌的殺滅效果[20]。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，首次嘗試將此方法應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌，發(fā)現(xiàn)10 min以內(nèi)的短時間處理同樣可以發(fā)揮很好的殺菌效果，而相同抗生素濃度對創(chuàng)傷弧菌處理2 h，試驗4種抗生素中只有鏈霉素能夠殺滅1個數(shù)量級的創(chuàng)傷弧菌，而其他3種抗生素幾乎不能殺死細(xì)菌。結(jié)果表明，低離子休克促進(jìn)殺菌作用具有抗生素濃度和時間依賴效應(yīng)，但慶大霉素延長時間后，促進(jìn)殺菌效果先變強(qiáng)，后變?nèi)?，不同于其?種抗生素隨著時間延長殺菌效果持續(xù)增加，可能是由于不同種類的藥物之間存在差異，這其中的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?？股財z取試驗表明，低離子休克促進(jìn)抗生素殺滅創(chuàng)傷弧菌的分子機(jī)制在于促進(jìn)細(xì)菌對抗生素的攝取。

新藥的研發(fā)速度顯然跟不上細(xì)菌耐藥出現(xiàn)的速度，因此解決細(xì)菌耐藥問題，增強(qiáng)現(xiàn)有抗生素殺菌效果的方法具有光明前景。本研究在低離子環(huán)境下，采用較低抗生素濃度、更短處理時間，發(fā)現(xiàn)低離子休克可以增加氨基糖苷類抗生素殺滅創(chuàng)傷弧菌的效果。如果將此方法應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，可以減少抗生素用量和作用時間，有效降低抗生素殘留量和毒性，理論上是一種減緩創(chuàng)傷弧菌耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)的方式。雖然進(jìn)一步的應(yīng)用有待深入開展研究，但體外試驗已經(jīng)證明，低離子休克可以有效促進(jìn)抗生素殺滅耐受性強(qiáng)的平臺期創(chuàng)傷弧菌。