劉明勝， 陳文超， 蔡穎暢

(衢州市人民醫(yī)院 肛腸外科， 浙江 衢州 324000)

直腸癌(rectal cancer)是常見(jiàn)惡性腫瘤，放射治療是其重要治療手段，聯(lián)合手術(shù)治療可提高患者總生存率[1]。尋找對(duì)新輔助治療有預(yù)測(cè)性及整體生存有預(yù)后性的生物標(biāo)志物是直腸癌新輔助治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，研究報(bào)道lncRNA DNM3OS在胃癌組織和細(xì)胞系中上調(diào)，可作為胃癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)；抑制DNM3OS可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[3]。DNM3OS可影響口腔癌細(xì)胞的活力和遷移[4]。DNM3OS通過(guò)調(diào)節(jié)食管鱗狀細(xì)胞癌中的DNA損傷反應(yīng)而賦予放射抗性[5]。然而DNM3OS在直腸癌中的作用及其是否影響直腸癌SW-480的放射敏感性目前還尚未清楚。生物學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DNM3OS與miR-193a-3p有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-193a-3p在直腸癌患者治療前血漿樣品中顯著下調(diào)[6]。miR-193a-3p過(guò)表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，遷移[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA DNM3OS對(duì)直腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡及放射敏感性的影響及其機(jī)制是否與miR-193a-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本: 2015年6月至2020年6月衢州市人民醫(yī)院收治的具有完整臨床病理資料的直腸癌患者30例，全部患者經(jīng)病理檢查確診，通過(guò)手術(shù)切除其癌組織和癌旁組織；患者均知情且簽署知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：院字0122019)。

1.1.2 細(xì)胞與試劑：人直腸癌細(xì)胞系SW-480(ATCC)；RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco公司)；熒光定量PCR試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(日本同仁研究所)；凋亡檢測(cè)試劑盒(艾美捷科技有限公司)；蛋白裂解液(上海源葉生物科技有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(AAT Bioquest公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組： SW-480細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將DNM3OS干擾表達(dá)載體及陰性對(duì)照、miR-193a-3p模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至SW-480細(xì)胞中，記為si-DNM3OS組、si-NC組、miR-193a-3p組、miR-NC組；將DNM3OS干擾表達(dá)載體分別與miR-193a-3p抑制劑陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至SW-480細(xì)胞中，記為si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組。si-NC組、si-DNM3OS組、miR-NC組、miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細(xì)胞分別用4 Gy的射線照射后，記為4 Gy+si-NC組、4 Gy+si-DNM3OS組、4 Gy+miR-NC組、4 Gy+miR-193a-3p組、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)DNM3OS和miR-193a-3p的表達(dá)水平：提取組織和細(xì)胞RNA，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，以GAPDH和U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。DNM3OS上游引物序列：5′-CAAGGCTCTCACTTGTCCTG-3′，下游引物序列：5′-CAGCTGGAAACTGACCAAAG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游引物序列：5′-ACCTGGTCCTCAGTGTAGCC-3′；miR-193a-3p上游引物序列：5′-AACTGGCCTAC AAAGTCCCAGT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTG TCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGC AGCACATATAC-3′，下游引物序列：5′-AAAATATGG AACGCTTCACGA-3′。

1.2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性： si-NC組、si-DNM3OS組、miR-NC組、miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，分別給予0、2、4、6、8 Gy的射線照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)2周，吉姆薩染色后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落。采用GraghPad Prism5擬合細(xì)胞存活曲線。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率： 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說(shuō)明操作，加入MTT溶液和二甲基亞砜，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值。增殖抑制率=1-A實(shí)驗(yàn)組值/A空白組值×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡： 收集各組細(xì)胞，漂洗后按試劑盒說(shuō)明操作，加入Annexin V-FITC和PI，孵育后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)： 提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜封閉，然后加入一抗在4 ℃的冰箱中過(guò)夜；加入二抗室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將DNM3OS的野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-193a-3p共轉(zhuǎn)染至SW-480細(xì)胞中，按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直腸癌組織中的表達(dá)

直腸癌組織中DNM3OS表達(dá)水平高于癌旁組織，miR-193a-3p表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with adjacent tissues圖1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直腸癌組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p

2.2 抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞放射敏感性的影響

與si-NC組比較，si-DNM3OS組DNM3OS表達(dá)水平降低(0.39±0.03比1.01±0.04，t=12.225，P<0.05)；不同劑量射線照射后si-DNM3OS組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低(P<0.05)，其放射增敏比為1.798(圖2)。

*P<0.05 compared with si-NC group圖2 抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響Fig 2 Effect of inhibiting the expression of lncRNA DNM3OS on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.3 抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)聯(lián)合4Gy照射對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞增殖和凋亡的影響

si-DNM3OS組SW-480細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率高于si-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平低于si-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)水平高于si-NC組(P<0.05)；4 Gy+si-DNM3OS組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+si-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平低于4 Gy+si-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)水平高于4 Gy+si-NC組(P<0.05)(圖3)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with si-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+si-NC group圖3 抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)聯(lián)合4 Gy照射對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig 3 Effect of inhibition of lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.4 lncRNA DNM3OS靶向調(diào)控miR-193a-3p的表達(dá)

Starbase預(yù)測(cè)顯示lncRNA DNM3OS與miR-193a-3p有結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。WT-DNM3OS與miR-193a-3p共轉(zhuǎn)染后的SW-480細(xì)胞熒光素酶活性低于與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.05)(圖4B)。過(guò)表達(dá)DNM3OS，miR-193a-3p表達(dá)水平降低；抑制DNM3OS表達(dá)，miR-193a-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖4C)。

A.binding site of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p; B.cellular luciferase activity; C.lncRNA DNM3OS regulates the expression of miR-193a-3p; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with pcDNA group; ▲P<0.05 compared with si-NC group圖4 lncRNA DNM3OS靶向調(diào)控miR-193a-3p的表達(dá)Fig 4 lncRNA DNM3OS targeting regulated the expression of

2.5 過(guò)表達(dá)miR-193a-3p對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞放射敏感性的影響

與miR-NC組比較，miR-193a-3p組miR-193a-3p表達(dá)水平升高(2.85±0.14比1.01±0.04，t=12.601，P<0.05)，不同劑量射線照射后miR-193a-3p組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低(P<0.05)，細(xì)胞放射增敏比為1.701(圖5)。

*P<0.05 compared with miR-NC圖5 過(guò)表達(dá)miR-193a-3p對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響Fig 5 Effect of over-expression of miR-193a-3p on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.6 過(guò)表達(dá)miR-193a-3p聯(lián)合4 Gy照射對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞增殖和凋亡的影響

miR-193a-3p組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率高于miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平低于miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)水平高于miR-NC組(P<0.05)；4 Gy+miR-193a-3p組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平低于4 Gy+miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)水平高于4 Gy+miR-NC組(P<0.05)(圖6)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+miR-NC group圖6 過(guò)表達(dá)miR-193a-3p聯(lián)合4 Gy照射對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig 6 Effect of over-expression miR-193a-3p combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.7 干擾miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞放射敏感性的影響

不同劑量照射后si-DNM3OS+anti-miR-NC組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)低于si-NC組，放射增敏比為1.745，si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)高于si-DNM3OS+anti-miR-NC組，放射增敏比為1.140；4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平高于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)水平低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組(P<0.05)(圖7，8)。

*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group圖7 干擾miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響Fig 7 Interfering miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

綜上所述，抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)可抑制SW-480細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)細(xì)胞的放射敏感性，其機(jī)制可能與miR-193a-3p有關(guān)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression;*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group圖8 干擾miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)聯(lián)合4 Gy照射對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig 8 Interference with miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

3 討論

新輔助放療是局部晚期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式，但不同患者對(duì)放療的反應(yīng)不同，因此，提高患者對(duì)其敏感性，對(duì)制定個(gè)體化的治療策略具有重要意義[8]。研究報(bào)道lncRNA DNM3OS可促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，遷移[9]。抑制DNM3OS表達(dá)可減少卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，直腸癌組織中DNM3OS表達(dá)水平升高，表明DNM3OS可能在直腸癌中起促癌作用。轉(zhuǎn)染DNM3OS干擾表達(dá)載體后，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，表明抑制DNM3OS可抑制SW-480細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染DNM3OS干擾表達(dá)載體后并用不同劑量射線照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低，表明抑制DNM3OS表達(dá)提高了癌細(xì)胞對(duì)放射射線的敏感性。此外，轉(zhuǎn)染DNM3OS干擾表達(dá)載體并用4 Gy的射線照射后細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率也顯著升高，表明抑制DNM3OS表達(dá)的同時(shí)用射線照射對(duì)SW-480細(xì)胞的抑癌作用更強(qiáng)。

研究表明，miRNA也參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[11]。已有研究表明，miR-193a-3p在直腸癌患者血漿中下調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，直腸癌組織中miR-193a-3p表達(dá)水平降低，與前人研究[6]結(jié)果相符，提示miR-193a-3p可能在直腸癌中起抑癌作用。此外，研究報(bào)道m(xù)iR-193a-3p可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的放射抗性[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)過(guò)表達(dá)miR-193a-3p或用射線照射，SW-480細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高，且不同劑量射線照射后，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低；表明過(guò)表達(dá)miR-193a-3p可抑制SW-480細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且可增加細(xì)胞的放射敏感性。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，DNM3OS靶向調(diào)控miR-193a-3p，干擾miR-193a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達(dá)對(duì)直腸癌SW-480細(xì)胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響。