楊佳卉，趙 微，解相宏，李春美，劉曉軍，姚 紅*

(1.山西醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 微生物學與免疫學教研室, 山西 太原 030001; 2.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國點重點實驗室, 北京 100005)

沉默信息調節(jié)因子1 (Sirtuin type 1, Sirt1)是一種在肝臟等代謝組織中高水平表達的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的III型組蛋白脫乙酰酶和單ADP核糖基轉移酶，Sirt1可使組蛋白(H1、H3、H4)和非組蛋白脫乙?；?，廣泛參與機體的代謝、衰老、轉錄、DNA損傷修復、細胞凋亡、細胞周期調控、炎性反應和腫瘤等多種生理和病理過程[2]。在肝臟中，Sirt1也參與眾多細胞生理功能, 包括肝臟葡萄糖和脂肪酸代謝、線粒體功能、肝糖異生等，對于葡萄糖、脂質和膽固醇穩(wěn)態(tài)是至關重要的[1]。為了探究肝細胞特異性Sirt1缺失在肝臟炎性反應中的作用，選取了肝特異性Sirt1敲除小鼠進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:實驗室保存肝臟特異性Sirt1敲除(Sirt1-LKO)雄鼠，野生型(wild type，WT)C57BL/6J雄性小鼠(SPF級，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所實驗動物中心)，飼養(yǎng)環(huán)境清潔級。

1.1.2 主要試劑:Trizol(Invitrogen公司)；SYBR Green Ⅰ Q-PCR kit(Promega公司)；蛋白酶抑制劑Cocktail，LPS(Sigma Aldrich公司)；Tris，SDS，甘氨酸(AMRESCO公司)；RIPA裂解液，PMSF(碧云天生物技術有限公司)；NF-κB抗體(Abclonal公司)；Tubulin抗體(Abmart公司)；胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司);高脂飼料(Research Diets公司)。

1.2 方法

1.2.1 體質量的監(jiān)測:每周固定時間進行體質量秤量并記錄。

1.2.2 小鼠原代肝細胞的分離及培養(yǎng):用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠(0.15 mL/10 g)，乙醇擦拭皮膚消毒，呈U字型剪開皮膚，打開腹腔，分離門靜脈，迅速將套管針置入門靜脈，退出套管，留置導管，立即注入肝素，迅速打開胸腔，剪開下腔靜脈，將門靜脈的導管與注射器相連，灌流液I灌流2 min。連通灌流液II灌流5 min至肝臟出現皸裂或水泡。用400目濾網篩選肝細胞，清洗細胞2次，棄上清，接種細胞。詳細操作請見參考文獻[1]。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達:倒掉培養(yǎng)液，用4 ℃預冷PBS清洗2遍，加入適量RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑Cocktail，PMSF的混合液，在4 ℃下旋轉孵育1 h，在 4 ℃預冷的離心機中以12 000 r/min離心15 min，將上清液轉移至放置在冰上新的1.5 mL Eppendorf(EP)管中, 取20 μL上清用于測定蛋白濃度，其余上清加入等體積的5×上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，提前制備凝膠，將蛋白樣品依次加入加樣孔，樣品兩側均加5 μL預染蛋白標記，設置電壓為80 V，待蛋白樣品壓成一條線，調節(jié)電壓為110 V，至溴酚藍達到膠的末端附近可停止電泳，然后用濕轉法，在300 mA的電流下將其轉至聚偏二氟乙烯膜上，電轉結束后，在室溫條件下用5%的脫脂牛奶封閉1 h,4 °C旋轉搖床孵育一抗過夜，用TBST洗膜3次，每次15 min,室溫孵育二抗1 h后再次洗膜，用ECL發(fā)光顯影液在天能化學發(fā)光儀中進行曝光。實驗詳細操作請見參考文獻[1]。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA：倒掉培養(yǎng)液，用4 ℃預冷PBS清洗2遍，用Trizol試劑來提取總RNA，定量2 μg的總RNA來配置20 μL的反應體系。反轉錄為cDNA并在PCR擴增儀上進行擴增反應，定量1 μL的cDNA模板，選用SYBR GreenIQ-PCR kit的20 μL反應體系。于Bio-Rad CFX96 real-time system上進行擴增和實時熒光的定量檢測，所檢測基因的表達均以β-actin進行均一化的處理。β-actin上游引物: 5′-CCAGCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，下游引物：5′-TGCTGGAAGGT GGACAGTGAG-3′; Tnfα上游引物：5′-CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3′，下游引物：5′-CGGACTCCGCAAAGTC-3′；IL6上游引物：5′-CCCAGGAGAAGATTCCAAAGATGTA-3′；下游引物:5′-GTCGAGGATGTACCGAATTTGTTT G-3′。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Sirt1-LKO鼠體質量下降趨勢

首先檢測了高脂喂養(yǎng)條件下小鼠體質量的變化情況，與對照組相比，Sirt1-LKO鼠也顯示體質量下降趨勢(P<0.05)(圖1)。

圖1 Sirt1-LKO鼠顯示體質量下降趨勢Fig 1 Sirt1-LKO mice showed a tendency to lose

2.2 Sirt1-LKO鼠顯示出對LPS刺激的低敏感性

生存曲線結果顯示，與WT小鼠相比，Sirt1-LKO鼠對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激表現低敏感 (圖2)。

圖2 Sirt1-LKO鼠對LPS刺激表現低敏感Fig 2 Sirt1-LKO mice showed low sensitivity to LPS

2.3 Sirt1-LKO鼠原代肝細胞中NF-κB表達增高

Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，Sirt1-LKO鼠原代肝細胞中核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)表達增高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with WT control圖3 Sirt1-LKO鼠原代肝細胞中NF-κB表達增高Fig 3 Increased expression of NF-κB in Primary hepatocytes of Sirt1-LKO mice n=6)

2.4 Sirt1-LKO鼠原代肝細胞Tnfα和IL6表達增高

結果顯示，WT小鼠原代肝細胞中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的轉錄水平明顯低于Sirt1-LKO組(圖4)。

*P<0.05 compared with WT control圖4 Sirt1-LKO鼠原代肝細胞Tnfα和IL6表達增高Fig 4 Sirt1-LKO mice primary hepatocytes Tnfα and IL6 expression increased n=6)

3 討論

炎性反應是指具有血管系統(tǒng)的活體組織對生物、物理、化學等損傷因子刺激所產生的一系列防御反應。 近年來, 隨著對炎性反應的認識越發(fā)全面, 炎性反應途徑已經被認定是許多慢性疾病發(fā)生和發(fā)展的關鍵分子基礎[3]。

LPS是革蘭陰性細菌細胞壁外壁的組成成分,其可以通過與細胞表面的模式識別受體結合，從而產生多種促炎細胞因子來啟動固有免疫應答[5]。LPS主要是以細胞膜表面的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)4為媒介，激活下游NF-κB[8]，從而激活部分炎性反應。NF-κB被認為是炎性反應的主要調節(jié)因子，它能夠調節(jié)免疫和炎性反應基因的轉錄。NF-κB的激活引發(fā)脂肪變性，從而產生Tnfα、IL6、IL1等促炎細胞因子，這些細胞因子的產生會觸發(fā)影響炎性反應的免疫系統(tǒng)細胞的募集和活化[6]。本研究中，Sirt1敲除會增加NF-κB的表達，促進Tnfα，IL6等炎性因子的分泌及表達，并對LPS刺激表現低敏感，表明Sirt1介導了LPS對NF-κB的作用。NF-κB和Sirt1信號通路都是進化上保守的維持體內平衡的機制，它們的相互作用使機體處于平衡，但NF-κB和Sirt1信號通路的相互作用是拮抗的[7]。

適度的Sirt1過度表達產生了對高脂肪誘導的肝脂肪變性和葡萄糖耐受不良的保護作用[9]。這就提示Sirt1的藥理活化可能是治療肝臟炎性反應肥胖相關代謝疾病的一種有效抗炎治療策略。但由于Sirt1在急性或慢性肝損害中引發(fā)的作用不一致，需要進一步研究在具體情況下使用Sirt1激活劑/抑制劑可能產生的益處/危害。