張春利，齊結(jié)華，宦 宇，吳守樂，蔡徐山

(上海市嘉定區(qū)婦幼保健院 檢驗科， 上海 201821)

宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，給女性的身心健康和生命安全帶來了嚴重威脅，且近年來發(fā)病趨于年輕化，病死率也一直居高不下。盡管宮頸癌篩查方法和治療技術(shù)已逐步優(yōu)化，但仍有大部分患者被確診時已處于晚期，治療方案較為有限，且副作用嚴重[1]。因此，有必要從分子生物學層面探索宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制，從而尋找有效的治療靶標。

去整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17, ADAM17)是一種鋅依賴性跨膜蛋白, 在人類的生長發(fā)育、炎性反應(yīng)和腫瘤等過程中發(fā)揮了重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17在正常組織和細胞中表達量較低，但在多種惡性腫瘤中表達量升高，且促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。已有研究表明，ADAM17 在宮頸癌組織中呈異常高表達，且與宮頸癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。然而，關(guān)于ADAM17在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學功能及作用機制目前尚未見相應(yīng)報道。因此，本研究旨在探討ADAM17對宮頸癌細胞增殖的影響，并對其機制進行初步研究，為以ADAM17為靶點的宮頸癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞HeLa(中科院上海細胞庫)。sh-ADAM17為本課題前期構(gòu)建而成。DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶(Hyclone公司)；胎牛血清FBS(Gibco公司)；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000(lipo2000)(Invitrogen公司)；兔抗人-ADAM17、-β-actin、-PCNA、-EGFR、-p-ERK及-ERK抗體(Cell Signaling公司)；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(Sigma Aldrich公司)；Transwell小室(Corning公司)；CCK-8試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與分組處理：將細胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天當細胞匯合度為90%左右時傳代。將對數(shù)增殖期的細胞鋪于6孔板中，第2天當細胞匯合度達60%～70%時，更換為無血清無雙抗培養(yǎng)基，分對照組和實驗組，按照lipo2000說明書將質(zhì)粒和脂質(zhì)體按1∶2.5的質(zhì)量體積比混合，室溫靜置20 min后進行轉(zhuǎn)染，5 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測ADAM17的表達：提取細胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，熒光定量PCR檢測ADAM17 mRNA的表達水平。每組3個復孔。ADAM17上游引物序列: 5′-AGAGCTGACCCAGATCCCAT-3′，下游引物序列: 5′-TACTCTCTTCCCCTCTGCCC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列: 5′-TGGGGAAGGTGAAGG TCGG-3′，下游引物序列: 5′-CTGGAAGATGGTGATG GGA-3′。

1.2.3 劃痕實驗檢測細胞的遷移：將細胞接種于6孔板，待匯合度達90%時，用無菌槍頭劃線，PBS清洗3次后，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、48 h觀察并固定位置拍照，實驗重復3次。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲：遷移實驗是將已轉(zhuǎn)染的細胞用無血清培養(yǎng)基重懸為單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整為5×105個/mL，在Transwell嵌套下室加入650 μL含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基，上室加入已制備好的細胞懸液100 μL，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽輕輕擦去上室細胞，浸入甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS洗滌3次，拍照并計數(shù)細胞，每組實驗重復3次，取均值進行比較。侵襲實驗：Transwell上室預(yù)先包被基質(zhì)膠，其余步驟均同Transwell遷移實驗。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞的增殖：將實驗組和對照組細胞分別接種于96孔板，2×103/孔，每組設(shè)4個復孔，并同時設(shè)置空白對照組，分別于24、48 和72 h加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，檢測各孔在490 nm處的吸光度(A值)，根據(jù)檢測結(jié)果繪制增殖曲線。

1.2.6 Western blot檢測細胞中相關(guān)蛋白的表達： 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入適量的含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分混勻后于冰上裂解20 min，4 ℃，13 000 r/min離心10 min，BCA法測蛋白濃度，煮沸變性，經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入一抗4 ℃孵育過夜；用已配制好的TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光法顯影分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌HeLa細胞中ADAM17干擾效率驗證

與對照組相比，干擾組ADAM17表達水平降低了58% (P<0.05)(圖1A)。干擾組ADAM17的蛋白表達量也明顯降低(P<0.05)(圖1B，C)。

A.expressions of ADAM17 mRNA in HeLa cells transfected by sh-ADAM17; B.expressions of ADAM17 protein in HeLa cells transfected by sh-ADAM17; C.relative protein levels of ADAM17 detected by densitometry; *P<0.05 compared with sh-control group圖1 sh-ADAM17介導的HeLa細胞ADAM17表達降低的驗證Fig 1 Verification of sh-ADAM17 mediated ADAM17 expression decrease in HeLa cells

2.2 干擾ADAM17對HeLa細胞遷移及侵襲能力的影響

與對照組相比，干擾組細胞遷移能力和侵襲能力無明顯變化。

2.3 干擾ADAM17對HeLa細胞增殖能力的影響

與對照組相比ADAM17干擾組細胞的增殖能力減弱(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sh-control group圖2 下調(diào)ADAM17基因表達對HeLa細胞增殖能力的影響Fig 2 The effect of knockdown of ADAM17 gene on the proliferation of HeLa cells

2.4 干擾ADAM17對相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組相比，ADAM17干擾組 PCNA、p-EGFR和p-ERK表達水平也明顯降低(P<0.05)(圖3A，B)。

A.expression of PCNA and proteins related to EGFR/ERK pathway in HeLa cells transfected by sh-ADAM17; B.relative levels of proteins detected by densitometry; *P<0.05 compared with sh-control group圖3 干擾ADAM17對PCNA、EGFR/ERK通路相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig 3 Effect of knockdown of ADAM17 gene on the protein expression of PCNA and EGFR/ERK pathway

3 討論

宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法主要為手術(shù)切除和放射、化學藥物治療，但不同患者對放、化療的敏感性差異較大，且不良反應(yīng)明顯；一些新型的免疫療法雖然初步展現(xiàn)出較好的前景，但仍需更深層次的探究才能真正應(yīng)用于臨床治療[7-8]。所以，對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制進行探索很有必要。

去整合素-金屬蛋白酶家族參與了包括生育、黏附、遷移、炎性反應(yīng)、蛋白水解及細胞傳導等在內(nèi)的多種生物學功能，作為該家族的重要一員，ADAM17在多種惡性腫瘤中顯著高表達[9]。與正常肝組織相比，肝癌組織中ADAM17表達明顯升高，且與肝癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[3]。ADAM17在胃癌組織及細胞中表達顯著升高，并和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可作為胃癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子[5]。已有研究表明，ADAM17在宮頸癌組織中異常高表達，且與宮頸癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。為進一步研究ADAM17在宮頸癌中的作用， 本研究將干擾ADAM17的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于人宮頸癌HeLa細胞中，結(jié)果表明，ADAM17不影響宮頸癌細胞的遷移及侵襲，但干擾ADAM17可顯著抑制宮頸癌細胞增殖。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為受體酪氨酸激酶家族中的重要成員之一，它參與人體多種生物學過程。已經(jīng)證實，EGFR在多種人類腫瘤中都異?；罨龠M腫瘤細胞的增殖、侵襲、抗凋亡及血管新生等[10]。而ADAM17可以水解EGFR 配體的前體，從而激活 EGFR 通路，進一步激活其下游信號通路，包括細胞外相關(guān)激酶(extracellular related kinase，ERK)、磷脂酰肌醇三激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)和AKT通路[11]。在轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA 的 MCF-7 乳腺癌裸鼠移植瘤模型中，隨著 ADAM17 表達下降，轉(zhuǎn)染組腫瘤組織中p-EGFR和p-ERK表達水平也降低，說明ADAM17通過EGFR/ERK 信號通路調(diào)控了乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的生長[12]。本研究結(jié)果表明，在宮頸癌HeLa細胞中干擾ADAM17表達也可使EGFR和ERK磷酸化水平降低。說明ADAM17可能是通過EGFR/ERK信號通路影響宮頸癌細胞增殖。

綜上所述，干擾ADAM17基因可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖，這可能是通過調(diào)控EGFR/ERK信號通路來實現(xiàn)的。本研究為以ADAM17為靶點的宮頸癌治療提供了實驗依據(jù)，但具體分子機制尚需要進一步探索。