国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

通痹顆粒通過(guò)TRAF3/PTPN22信號(hào)通路調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠T細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)研究

2022-02-19 08:49葛子靖王莘智徐豫湘范伏元
陜西中醫(yī) 2022年2期
關(guān)鍵詞:雷公藤穩(wěn)態(tài)關(guān)節(jié)炎

葛子靖,王莘智,徐豫湘,范伏元,田 英,劉 丹

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410007)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一類自身免疫性疾病,具有極高的致殘率[1]。主流觀點(diǎn)認(rèn)為,免疫細(xì)胞、因子都對(duì)RA的發(fā)展有決定性的影響[2]。T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)無(wú)疑是RA基礎(chǔ)研究及防治的關(guān)鍵核心[3]。T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。自噬可調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的存活及分化,并在T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。PTPN22是維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因,且可調(diào)節(jié)自噬依賴性的免疫因子的釋放[3]。研究發(fā)現(xiàn),TRAF3可通過(guò)PTPN22調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)通路[4]。根據(jù)上述研究成果進(jìn)行合理地推測(cè),RA的發(fā)病機(jī)制可能是TRAF3/PTPN22信號(hào)通路表達(dá)異常,影響B(tài)eclin1介導(dǎo)的T細(xì)胞自噬,從而導(dǎo)致T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡,進(jìn)而誘發(fā)RA的發(fā)生。通痹顆粒對(duì)“氣血虧虛、寒濕痹阻”型RA患者療效顯著;實(shí)驗(yàn)研究表明其能改善患者中醫(yī)證候,并能減少血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平[5-7]。本研究試從T細(xì)胞自噬角度闡明通痹顆粒治療RA的作用機(jī)制,為中藥防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Wistar大鼠:雄性,平均體重(1000±20) g,鼠齡 8~10周,清潔級(jí)。從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:受試中藥為通痹顆粒,由當(dāng)歸、全蝎、沒(méi)藥、白芍、乳香、川芎、桂枝、黃芪、僵蠶、黃柏等組成,來(lái)源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,屬院內(nèi)制劑。制備方法:取通痹顆粒6 g,用10 ml無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液溶解,搖勻,制成0.6 g/ml藥液,放至4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

西藥陽(yáng)性藥:雷公藤多苷片(濃度1 mg/ml),灌胃,劑量8.75 ml/kg,1次/d,連續(xù)16 d。

1.1.3 主要試劑:完全弗氏佐劑 (CFA) ,購(gòu)于 Sigma公司(批號(hào):SLBQ1106 V)。Beclin1自噬信號(hào)Vps34的阻斷劑3-MA,可購(gòu)于Sigma公司。TNF-α、TGF-β、IL-1試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。TRAF3、PTPN22和Beclin1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與分組:采用CFA的方法復(fù)制RA大鼠模型。除正常組外,其余大鼠均向右后足墊部皮內(nèi)注射CFA 0.15 ml。24 h后大鼠右足踝部出現(xiàn)急性炎性腫脹,48 h后大鼠足致炎側(cè)、非致炎側(cè)或雙側(cè)前肢關(guān)節(jié)有腫脹,有的大鼠甚至耳、尾部出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié),在致炎7 d后注射第2次,8~12 d則制成佐劑性關(guān)節(jié)炎模型[8],致炎后淘汰造模不成功大鼠,選取病變明顯大鼠 48只適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,根據(jù)體重隨機(jī)分為五組,即:RA模型組(灌胃0.9%氯化鈉溶液)、雷公藤多苷組(灌胃雷公藤多苷藥液)、通痹顆粒組(灌胃通痹顆粒藥液)、3-MA組(灌胃Beclin1自噬信號(hào)Vps34的阻斷劑3-MA)、聯(lián)合組(同時(shí)灌胃Beclin1自噬信號(hào)Vps34的阻斷劑3-MA和通痹顆粒藥液),另設(shè)正常對(duì)照組。治療組大鼠采用成人劑量的3倍用藥,2次/d,連續(xù)16 d。正常對(duì)照組以等容積的蒸餾水代替。16 d后處死各組大鼠,按要求留取血樣及組織作相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè):①大鼠整體指標(biāo)評(píng)價(jià)采用千分卡尺測(cè)量每組后足跖厚度,每3 d檢查大鼠并記錄和分析數(shù)據(jù),全面評(píng)估大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和后爪關(guān)節(jié)腫脹度。②血液學(xué)檢測(cè):治療16 d后所有大鼠斷頭取血分離血清備測(cè),采用懸液芯片檢測(cè)大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1、TGF-β、TNF-α的含量。檢測(cè)流程嚴(yán)格按照懸液芯片檢測(cè)操作流程進(jìn)行。③信號(hào)通路相關(guān)蛋白和基因的檢測(cè):取關(guān)節(jié)滑膜組織30 mg,加入200 μl 蛋白裂解液徹底混勻。冰上組織裂解 15 min,勻漿后離心 10 min。取上清,用 BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后,將各樣本蛋白濃度調(diào)整至相同,將定量好的各樣本按1∶1比例加入上樣緩沖液混勻,煮沸變性 5 min 后保存于-20 ℃ 備用。采用Western blot技術(shù)檢測(cè)TRAF3基因和PTPN22、Beclin1蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用t檢驗(yàn)和組間方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠右足跖厚度比較 見(jiàn)表1。治療后各治療組大鼠右足跖厚度均低于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較大鼠右足跖厚度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。聯(lián)合組大鼠右足跖厚度明顯低于其他治療組(P<0.05)。

2.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較 見(jiàn)表2。治療后各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均低于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于其他治療組(P<0.05)。

2.3 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β水平比較 見(jiàn)表3。治療后各治療組血清IL-1、TNF-α水平均低于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較,大鼠血清IL-1、TNF-α水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),聯(lián)合組血清IL-1、TNF-α水平均明顯低于其他治療組。治療后各治療組血清TGF-β水平均高于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較,大鼠血清TGF-β水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05) ,聯(lián)合組血清TGF-β水平均明顯高于其他治療組(P<0.05)。

表3 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β水平比較

2.4 大鼠TRAF3基因、PTPN22和Beclin1蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組比較,RA模型組TRAF3基因表達(dá)水平下調(diào),PTPN22蛋白和Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)。與RA模型組相比,雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組TRAF3基因表達(dá)水平上調(diào),PTPN22蛋白Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.05),三組之間比較,各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。聯(lián)合組滑膜組織TRAF3蛋白表達(dá)水平與其他治療組相比上調(diào),PTPN22蛋白和Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)。

表4 大鼠TRAF3基因、PTPN22和

3 討 論

T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是RA基礎(chǔ)研究及防治的關(guān)鍵核心。T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是指外周T 細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞存活及增殖等來(lái)維持自身數(shù)目平衡,從而行使正常的免疫功能,當(dāng)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化可影響RA的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常功能、抵制病原體至關(guān)重要。機(jī)體通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞的增殖與凋亡調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞數(shù)目,以便T細(xì)胞群迅速響應(yīng),識(shí)別并清除病原體[11-12]。RA患者T細(xì)胞免疫耐受降低并伴隨著其凋亡程度的減少[13]。

越來(lái)越多的研究提示自噬在T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。自噬可調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的存活及分化,且與T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。自噬的增多或者降低可打破T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[14]。最近研究發(fā)現(xiàn),PTPN22基因是引發(fā)RA的關(guān)鍵原因[15-16]。PTPN22能夠編碼磷酸酶,通過(guò)將T細(xì)胞信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子去磷酸化而抑制TCR的信號(hào)活性。PTPN22的降低導(dǎo)致NLRP3介導(dǎo)的 IL-1β分泌缺失,而PTPN22基因增加可以促進(jìn)炎性系統(tǒng)的激活[17],同時(shí),PTPN22以自噬依賴的方式調(diào)節(jié)NLRP3介導(dǎo)的IL-1β分泌。最新研究發(fā)現(xiàn), TRAF3 可控制PTPN22 從胞質(zhì)向胞膜的轉(zhuǎn)移,并抑制PTPN22 在TCR復(fù)合物亞基中的去磷酸化[17-19]。Beclin1可與Vps34共同調(diào)節(jié)自噬體膜的合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。綜上所述, RA的發(fā)病機(jī)制可能是TRAF3/PTPN22信號(hào)通路表達(dá)異常,影響B(tài)eclin1介導(dǎo)的T細(xì)胞自噬,從而導(dǎo)致其穩(wěn)態(tài)失衡,誘發(fā)RA的發(fā)生。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇,《素問(wèn)·痹論》云:“風(fēng)寒濕三氣雜至,合而為痹”,此言其外因。故《素問(wèn)·評(píng)熱病論》指出:“風(fēng)雨寒熱,不得虛,不能獨(dú)傷人”,又指出:“不與風(fēng)寒濕氣合,故不為痹”。說(shuō)明外因只是發(fā)病的條件,內(nèi)因才是發(fā)病的根本原因[21]。因此,RA乃本虛標(biāo)實(shí)之證,內(nèi)因主要為患者病久肝腎氣血營(yíng)衛(wèi)內(nèi)虛;外因是風(fēng)寒濕熱侵襲。其病機(jī)主要表現(xiàn)為氣血虧虛、寒濕痹阻、營(yíng)衛(wèi)不和、陰陽(yáng)失調(diào)等,治當(dāng)以益氣養(yǎng)血,祛風(fēng)除濕,通絡(luò)止痛為法[22]。

通痹顆粒是本課題組研發(fā)治療RA的中藥復(fù)方,由當(dāng)歸、白芍、黃芪、川芎、全蝎、僵蠶、乳香、沒(méi)藥、桂枝、黃柏等組成,具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕之效,可有效緩解RA的癥狀并降低RA患者血清中的炎癥因子[23]。方中以當(dāng)歸為君,白芍、黃芪為臣,川芎、全蝎、僵蠶、乳香、沒(méi)藥、桂枝、黃柏為佐藥。當(dāng)歸養(yǎng)血活血;白芍與川芎共用活血調(diào)氣,助君藥活血化瘀,養(yǎng)血健脾;黃芪大補(bǔ)氣血;乳香、沒(méi)藥活血生肌,散瘀止痛;全蝎、僵蠶通絡(luò)止痛;桂枝通經(jīng)散寒;黃柏清熱解毒;甘草調(diào)和諸藥,共奏活血調(diào)氣、通絡(luò)止痛、清熱利濕的功效。

本研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,RA模型組IL-1、TNF-α血清水平顯著增加,關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及足跖腫脹明顯上調(diào)。再次證實(shí)了RA模型組大鼠炎性指標(biāo)的異常表達(dá)與關(guān)節(jié)損傷有密切聯(lián)系。通痹顆粒組以及聯(lián)合組的IL-1、TNF-α血清水平顯著降低,關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及足跖腫脹明顯下降,說(shuō)明通痹顆粒組能夠有效抑制炎癥反應(yīng),保護(hù)RA患者關(guān)節(jié)。本研究結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,RA模型組TRAF3基因表達(dá)水平下調(diào),PTPN22蛋白Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào),提示RA模型組大鼠滑膜免疫炎性損傷與TRAF3低表達(dá)和PTPN22蛋白以及Beclin1蛋白高表達(dá)相關(guān)。與RA模型組比較,通痹顆粒組以及聯(lián)合組滑膜組織TRAF3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),PTPN22蛋白和Beclin1蛋白低表達(dá),表明通痹顆粒組抑制RA模型大鼠滑膜炎癥反應(yīng)可能與其上調(diào)免疫炎性抑制蛋白 TRAF3,下調(diào)PTPN22和Beclin1蛋白的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述,通痹顆粒方治療RA模型大鼠的機(jī)制可能與上調(diào)TRAF3基因,下調(diào)PTPN22和Beclin1的表達(dá),從而抑制T細(xì)胞自噬,使T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù),減少炎癥細(xì)胞因子釋放,緩解大鼠關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)炎狀態(tài),起到治療RA的作用。

猜你喜歡
雷公藤穩(wěn)態(tài)關(guān)節(jié)炎
衰老相關(guān)的蛋白穩(wěn)態(tài)失衡
一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定雷公藤藥材及制劑雷公藤多苷片中7個(gè)質(zhì)控成分
可變速抽水蓄能機(jī)組穩(wěn)態(tài)運(yùn)行特性研究
非布司他治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效
Red panda Roshani visits Melbourne Zoo vet
關(guān)節(jié)炎的“養(yǎng)護(hù)手冊(cè)”
不同炮制方法對(duì)雷公藤中雷公藤內(nèi)酯甲和雷公藤甲素的影響
電廠熱力系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)仿真軟件開(kāi)發(fā)
雷公藤多苷片聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效
元中期歷史劇對(duì)社會(huì)穩(wěn)態(tài)的皈依與維護(hù)
抚顺市| 巴林左旗| 信宜市| 北碚区| 铜陵市| 新宾| 池州市| 南川市| 旌德县| 镇远县| 芜湖县| 乐陵市| 舟曲县| 沁源县| 连南| 寿阳县| 本溪市| 手游| 四子王旗| 广丰县| 德兴市| 吉林省| 二手房| 吕梁市| 德格县| 新郑市| 共和县| 浮梁县| 盈江县| 太仆寺旗| 织金县| 石楼县| 钟山县| 隆德县| 磴口县| 蛟河市| 乐清市| 无为县| 阿克苏市| 赤城县| 楚雄市|