于芳春，劉向國(guó)，方 芳，謝桂元，吳百合

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，反復(fù)的氣道及肺組織炎癥浸潤(rùn)是COPD的發(fā)病機(jī)制之一。免疫機(jī)制在COPD炎癥啟動(dòng)、惡化和維持中發(fā)揮重要作用，免疫功能的紊亂如T淋巴細(xì)胞尤其是輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th細(xì)胞)的分泌和表達(dá)失衡可直接導(dǎo)致COPD的發(fā)生[1]。機(jī)體正常情況下，Th1/Th2系統(tǒng)維持相對(duì)平衡狀態(tài)，臨床上可以通過(guò)監(jiān)測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)情況，進(jìn)行診斷疾病和判斷預(yù)后[2]，Th1或Th2的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)可由Th1/Th2的比值體現(xiàn)。白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，IL-4)和干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)作為T(mén)h1、Th2細(xì)胞的代表因子，對(duì)其比值的探究可以揭示免疫機(jī)制在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用。具有補(bǔ)氣功效的六味補(bǔ)氣方可以緩解COPD患者咳嗽咳痰、呼吸困難、氣短乏力等癥狀，控制氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，改善肺功能和免疫功能[3]，但其免疫學(xué)機(jī)制尚未明確，本研究基于Th1/Th2類(lèi)細(xì)胞平衡的免疫理論進(jìn)行探究。煙草中的煙堿等有機(jī)成分及吸煙形成的顆粒是導(dǎo)致COPD發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4-5]，本研究通過(guò)香煙煙熏聯(lián)合脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)制備COPD大鼠模型，使用六味補(bǔ)氣方進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步探索六味補(bǔ)氣方治療COPD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取鼠齡為42～49 d的健康SD雄性大鼠40只，SPF級(jí)，體重(180±20)g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXY(魯)20190003，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，環(huán)境溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、桂龍咳喘寧組、六味補(bǔ)氣方組，每組10只，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 六味補(bǔ)氣方組方藥物：炙黃芪15 g，生曬參、玉竹各10 g，益智仁、陳皮各6 g，肉桂3 g，由安徽省中醫(yī)院中藥房提供；桂龍咳喘寧片購(gòu)自江西藥都仁合制藥有限公司，0.5 g/片，批號(hào)：Z20053135；LPS購(gòu)自Solarbio生物科技公司,批號(hào):L8880；紅三環(huán)牌卷煙購(gòu)自滁州卷煙廠：焦油含量13 mg，煙堿含量1.1 mg，批號(hào)：CZYC6901028128742；IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：KS14667，IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：KS14536，均購(gòu)于科順生物科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 煙熏箱(1 m×1 m×1 m)，自制；動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀(型號(hào)Ani Rws 2005，北京貝蘭博公司)，石蠟切片機(jī)，(型號(hào)RM2016，上海徠卡儀器有限公司)，生物組織石蠟包埋機(jī)(型號(hào)JB-P5，武漢俊杰電子有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)Eppen-dorf5424，德國(guó)艾本德有限公司)，正置光學(xué)顯微鏡(型號(hào)NIKONECLPSE Ci，日本尼康公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠COPD模型制作：參照宋一平等[6]采用香煙煙霧聯(lián)合氣管內(nèi)滴入LPS的造模方法，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)的第1天和第14天，使用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，手術(shù)暴露氣管，注入LPS(1 ml/1 mg)200 μl至氣管內(nèi)。除LPS滴入當(dāng)日，其余每日進(jìn)行卷煙煙熏：將大鼠置于自制的煙熏箱中，20支卷煙混合100 g鋸末點(diǎn)燃煙熏，每日煙熏1次，每次煙熏30 min，共計(jì)煙熏造模4周。COPD模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)大鼠一般情況變化如呼吸系統(tǒng)改變、咳嗽、呼吸道痰鳴音及分泌物增多，大鼠肺功能降低，肺組織病理學(xué)變化如肺組織黏膜下炎性細(xì)胞侵蝕、支氣管狹窄等進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4.2 藥物干預(yù)：每組大鼠于造模第5周第1天開(kāi)始灌胃干預(yù)，1次/d，持續(xù)15 d。正常對(duì)照組和模型組大鼠分別灌服相應(yīng)劑量的0.9%氯化鈉溶液10 ml/(kg·d)，桂龍咳喘寧組大鼠灌服桂龍咳喘寧片混懸液0.82 g/(kg·d)(相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的10倍)，六味補(bǔ)氣方組大鼠灌服六味補(bǔ)氣方混懸液1.06 g/(kg·d)(相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的20倍)，為課題組前期研究的有效實(shí)驗(yàn)劑量。

1.5 觀察指標(biāo)及方法 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察并記錄大鼠呼吸、進(jìn)食、排泄、精神及活動(dòng)等狀況；于造模第4周結(jié)束和藥物干預(yù)結(jié)束后測(cè)定各組大鼠肺功能：3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，手術(shù)露出氣管并插管，采用肺功能檢測(cè)儀記錄系統(tǒng)中呼氣峰流速(Peak expiratory flow，PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(Forced expiratory volumein 0.3 seconds，F(xiàn)EV0.3)、用力肺活量(Forced vital capacity，F(xiàn)VC)、及FEV 0.3與FVC的比值(FEV0.3/FVC)。待大鼠肺功能檢測(cè)完畢后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血；收集肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)：露頸部氣管，于氣管上剪一小口，插入針管并用縫合線(xiàn)扎緊固定，通過(guò)反復(fù)注入0.9%氯化鈉溶液抽吸后收集BALF，將血液與BALF分別注入試管，3000 r/min離心5 min，抽取血清及BALF上清液，ELISA法檢測(cè)IL-4、IFN-γ水平。打開(kāi)胸腔，取出肺組織，沖洗并置于4%多聚甲醛中固定48 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)5 μm厚切片，作蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察肺組織的病理學(xué)改變并攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)比較選擇Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況及呼吸系統(tǒng)癥狀的變化 正常對(duì)照組大鼠精神良好，毛發(fā)光澤，呼吸、抓鼻、體重增長(zhǎng)等均正常；與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)喉間及氣道痰鳴音、咳嗽咳喘，食欲降低，神疲倦嗜臥，毛發(fā)枯槁無(wú)澤，脫毛明顯、活動(dòng)減少等表現(xiàn)，隨著造模時(shí)間推移，上述表現(xiàn)逐漸增加。藥物干預(yù)組大鼠在造模期間表現(xiàn)與模型組相同，經(jīng)藥物干預(yù)后，用藥組大鼠一般情況和呼吸系統(tǒng)癥狀均有不同程度改善，以六味補(bǔ)氣方組改善最為明顯。

2.2 大鼠肺功能的變化 見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，桂龍咳喘寧組和六味補(bǔ)氣方組大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明顯增高(P<0.05)；與桂龍咳喘寧相比，六味補(bǔ)氣方組大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC(%)和PEF值均明顯增高(P<0.05)，F(xiàn)EV0.3值增高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠肺功能參數(shù)比較

2.3 大鼠肺組織的病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠氣管及各級(jí)支氣管結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮細(xì)胞未破壞，纖毛規(guī)整未見(jiàn)倒?fàn)?、粘連，無(wú)腺體肥大增生及黏液、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、支氣管管腔擴(kuò)大，肺泡壁、肺間隔未見(jiàn)異常。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠氣管及支氣管變窄，黏膜上皮出現(xiàn)破損，甚至壞死剝落，大量炎性細(xì)胞侵蝕肺間質(zhì)和肺實(shí)質(zhì)，支氣管黏膜下肌層增生肥厚，細(xì)支氣管、肺泡管和肺泡囊擴(kuò)大，部分肺泡萎陷相互融合構(gòu)成肺大皰；與模型組相比，桂龍咳喘寧組和六味補(bǔ)氣方組大鼠氣道炎性浸潤(rùn)減輕，支氣管黏膜和肺組織病理學(xué)有不同程度改善，其中以六味補(bǔ)氣方組改善最為明顯(圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×200)

2.4 各組大鼠血清及BALF中IL-4、IFN-γ水平的變化 見(jiàn)表2、3。與正常對(duì)照組相比，模型組血清及BALF中IFN-γ水平明顯下降，IL-4水平明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，桂龍咳喘寧組和六味補(bǔ)氣方組血清及BALF中IFN-γ水平明顯升高，IL-4水平明顯下降(均P<0.05)；與桂龍咳喘寧組相比，六味補(bǔ)氣方組血清及BALF中IFN-γ水平明顯升高，IL-4水平明顯下降(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比較

表3 各組大鼠BALF中IL-4、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比較

3 討 論

COPD多屬于中醫(yī)學(xué)“肺脹”的范疇，以胸部脹滿(mǎn)，憋悶如塞，氣促喘息，咳嗽痰多為臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重者可見(jiàn)煩躁，甚則出現(xiàn)驚厥、神昏、喘脫等危重證候，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈[7]。病因病機(jī)為正氣虛弱，外感六淫之邪，本質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，痰飲為最主要的病理因素之一。COPD治療上以“補(bǔ)肺氣”為根本方法[3]，穩(wěn)定期以補(bǔ)虛扶正為主，急性加重期以宣肺祛邪、降氣化痰、活血化瘀為主?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未完全明確COPD的發(fā)病機(jī)制，但炎癥機(jī)制在其病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，被激活的炎癥細(xì)胞同時(shí)釋放多種炎性介質(zhì)對(duì)肺部結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，同時(shí)促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)[8]。COPD患者存在氣道黏膜免疫缺陷及紊亂，免疫紊亂常與Th1/Th2、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg細(xì)胞)失衡有關(guān)[9]。臨床中的免疫狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)眾多，其中Th1/Th2是與免疫功能密切相關(guān)的指標(biāo)，且其中的各類(lèi)細(xì)胞因子對(duì)機(jī)體的炎性應(yīng)激程度有積極的反應(yīng)價(jià)值[10]。

Th1和Th2細(xì)胞同屬具備免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，COPD患者存在Th1細(xì)胞因子水平下降，Th2細(xì)胞因子水平升高，即出現(xiàn)Th2型細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)反應(yīng)[11]。Th1細(xì)胞數(shù)量與肺氣腫嚴(yán)重程度相關(guān)，可通過(guò)分泌炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)氣道炎癥，其細(xì)胞水平下降使機(jī)體清除感染源的能力降低[12-13]。Th2細(xì)胞的增多會(huì)引起炎癥和慢性組織損傷，導(dǎo)致氣道壁增厚[14]，進(jìn)一步削弱機(jī)體對(duì)感染因子的保護(hù)防御機(jī)制，并引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，這可能是誘發(fā)COPD急性加重、急性期感染不易控制的原因之一[15]，糾正Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡，保持其動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)防治COPD大有裨益。

IFN-γ是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的小分子多肽，Th1細(xì)胞主要通過(guò)分泌IFN-γ參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗細(xì)胞內(nèi)病原體感染的作用，其水平可直接反映Th1的表達(dá)程度[16]。IFN-γ具有高度的種屬特異性，可通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，并促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，引起氣道炎癥及呼吸爆發(fā)[17]。IFN-γ還可拮抗Th2對(duì)細(xì)胞因子的分泌作用，導(dǎo)致Th1/Th2失衡加劇與異常的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答[18]。COPD的發(fā)生和急性加重也與IFN-γ的表達(dá)密切相關(guān)，其過(guò)度表達(dá)可破壞患者氣道和肺泡內(nèi)的蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致氣道炎癥和肺泡壁的溶解破裂[19]；IL-4是由CD4+T細(xì)胞中Th2和CD8+Tc2細(xì)胞分泌的一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，是Th2細(xì)胞最具代表性的細(xì)胞因子。IL-4水平升高能抑制Th1細(xì)胞水平和活性，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的結(jié)合而引起氣道乃至全身的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加劇，亦能誘導(dǎo)釋放促嗜酸性粒細(xì)胞聚集的細(xì)胞因子和促炎因子，增加氣道黏液分泌，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的趨化和激活，導(dǎo)致氣道重塑[20]。IL-4還參與肺氣腫的發(fā)生，其通過(guò)刺激基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metallo proteinases-2，MMP-2)、MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄，引起蛋白酶/抗蛋白酶失衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和膠原纖維的增生[21]。基于此，本研究通過(guò)觀察IFN-γ、IL-4在COPD模型大鼠中濃度的改變，評(píng)價(jià)Th1/Th2平衡的失調(diào)，從而揭示六味補(bǔ)氣方干預(yù)COPD的作用途徑。

西藥常用β受體激動(dòng)、促進(jìn)支氣管擴(kuò)張的藥物成分和糖皮質(zhì)激素聯(lián)合發(fā)揮長(zhǎng)效藥性治療COPD，但長(zhǎng)期使用上述藥物不良反應(yīng)較為明顯[22]，中醫(yī)藥在治療COPD具有整體調(diào)節(jié)與安全有效的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以辨證論治為指導(dǎo)原則，標(biāo)本兼顧，對(duì)癥治療[23]。六味補(bǔ)氣方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院特色院內(nèi)制劑，是名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)的傳承，組方中炙黃芪益氣固表補(bǔ)中，生曬參行氣活血、補(bǔ)脾益肺，益智仁溫脾固腎，助參、芪補(bǔ)氣，三藥從脾、肺、腎三臟補(bǔ)氣；玉竹滋陰潤(rùn)燥、生津止渴，陳皮理氣健脾、燥濕化痰，肉桂溫中散寒。全方陰陽(yáng)、寒溫相濟(jì)，補(bǔ)中寓通不留邪。實(shí)驗(yàn)證明六味補(bǔ)氣方可明顯改善COPD患者咳嗽、氣喘、胸悶等癥狀[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，組方中炙黃芪其有效成分黃芪多糖與黃芪甲苷與可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，發(fā)揮較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[24]；生曬參主要成分人參皂苷Rh1可通過(guò)抑制IFN-γ釋放，促進(jìn)IL-4表達(dá)，抑制炎癥因子表達(dá)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和改善肺組織病理變化[25]；玉竹活性成分C(玉竹多糖)能有效刺激IFN-γ釋放，發(fā)揮抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用，誘導(dǎo)偏向Th2型免疫應(yīng)答[26]。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，六味補(bǔ)氣方可以抑制COPD模型大鼠血清及BALF中IL-8、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放，緩解氣道炎癥。

本研究結(jié)果顯示，COPD模型大鼠經(jīng)六味補(bǔ)氣方和桂龍咳喘寧干預(yù)后，一定程度上減少了COPD模型大鼠肺功能的惡化，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及感染減少，大鼠氣道阻塞情況改善，肺通氣功能緩解。模型組大鼠較正常對(duì)照組大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，血清及BALF中IL-4含量升高，IFN-γ含量降低，予以藥物干預(yù)后治療組大鼠IL-4含量降低，IFN-γ水平升高，提示氣道慢性炎癥和反復(fù)感染的情況得以緩解；模型組大鼠的IFN-γ/IL-4的比值較正常對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明模型組存在Th1/Th2平衡向Th2方向移動(dòng)，呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢(shì)狀態(tài)。與藥物干預(yù)治療后，IFN-γ/IL-4的比值升高，Th1/Th2平衡向Th1方向移動(dòng)，出現(xiàn)了Th1/Th2的比值逆轉(zhuǎn)，提示吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的宿主細(xì)胞免疫防御反應(yīng)增強(qiáng)，感染被有效控制。

綜上所述，六味補(bǔ)氣方改善COPD模型大鼠肺功能，減少肺組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及感染，增強(qiáng)其免疫力，增加IFN-γ及減少I(mǎi)L-4含量，糾正Th1/Th2失衡，是通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫實(shí)現(xiàn)的。Th1、Th2分泌諸多細(xì)胞表面物質(zhì)，IL-4、IFN-γ只是迄今為止最有代表性的一種，完全具有特異性及鑒別性質(zhì)的因子有待進(jìn)一步研究挖掘。