楊春靜，時(shí)正媛，續(xù)茜橋，寶 麗，游龍?zhí)?健

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京 100038；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029)

注意缺陷多動(dòng)障礙(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)是多始發(fā)于兒童時(shí)期并延續(xù)至成年的神經(jīng)精神疾病，俗稱小兒多動(dòng)癥。近年來(lái)由于環(huán)境、教育等因素，ADHD的發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)。研究表明，ADHD的病因與氧化應(yīng)激有關(guān)[1-3]。治療ADHD的藥物主要包括中樞興奮劑、中樞NE調(diào)節(jié)劑等，但容易出現(xiàn)頭痛、影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育等不良反應(yīng)[4-5]。鑒于ADHD病因復(fù)雜、病程長(zhǎng)的特點(diǎn)結(jié)合中藥多成分、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)，研究及開(kāi)發(fā)治療ADHD的中藥復(fù)方意義重大。

靜寧顆粒是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院兒科王俊宏主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)方，治療ADHD療效顯著。原方由太子參、熟地、枸杞子、五味子、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓等組成，主要適用于氣陰兩虛證的小兒多動(dòng)癥。目前關(guān)于靜寧顆粒的研究主要集中于HPA軸、神經(jīng)遞質(zhì)等方面[6]，而對(duì)其抗氧化作用的研究很少。因此，本課題通過(guò)對(duì)原代皮層神經(jīng)元采取過(guò)氧化氫(H2O2)刺激，模擬氧化應(yīng)激損傷過(guò)程，觀察靜寧顆粒對(duì)H2O2誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器 懷孕14 d的C57BL/6孕鼠購(gòu)自斯貝福生物技術(shù)有限公司(北京)。靜寧顆粒干浸膏(實(shí)驗(yàn)室自制，溶液澄清，pH=7.1，滲透壓=305 mOsm)；H2O2溶液(天津化學(xué)試劑廠)；NEUROBASAL MED SFM培養(yǎng)基、馬血清、Hank’s平衡鹽溶液、谷氨酰胺、葡萄糖溶液、B27 Supplement多聚鳥(niǎo)氨酸購(gòu)自Gibco生命科技公司(美國(guó))；青霉素-鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)；MTT染色液(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；DAPI染色液、活性氧檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司；微量還原型谷胱甘肽測(cè)試盒、丙二醛檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、PMSF試液、BCA蛋白定量試劑盒、脫脂奶粉購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Bax、Bcl-2、p53、HO-1和Nrf2等購(gòu)自Cell Signaling Technology(美國(guó))。

流式細(xì)胞儀(美國(guó))；DG-300C電泳儀(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；DYCZ-24DN型垂直電泳裝置(北京市六一儀器廠)；VE-386型轉(zhuǎn)移電泳槽(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波科技生物有限公司)。

1.2 原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞提取及傳代培養(yǎng) 取懷孕14 d的小鼠(經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院科學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn))，脫頸椎處死，用75%乙醇擦拭肚皮消毒，取出胎鼠。迅速將其移至裝有PBS溶液的培養(yǎng)皿。然后將胎鼠置解剖顯微鏡分離左右腦和腦干，剪掉嗅球，剝離腦膜，剪取顏色淺的部分即得透明月牙形的皮層，用顯微剪剪碎。以上所有操作均在冰上進(jìn)行。用預(yù)熱的0.1%的胰酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中消化10～15 min。消化結(jié)束后，吸棄胰酶，用預(yù)先配置好的培養(yǎng)基清洗兩次以洗掉殘余的胰酶。然后加入培養(yǎng)基，輕輕吹打至被全部吹散。用200目的細(xì)胞篩過(guò)濾、計(jì)數(shù)、種板。在生物安全柜中靜置15 min后，放入到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。種板后4 h，換液。每隔1 d換1次，每次1/3換液。

1.3 靜寧顆粒對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響 將原代神經(jīng)元接種于96孔板，培養(yǎng)至第9天時(shí)進(jìn)行分組處理，分為空白組、各用藥組(2.5、2.0、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/ml靜寧顆粒)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力[7]。

1.4 H2O2造模濃度的篩選 將原代神經(jīng)元接種于96孔板，培養(yǎng)至第9天時(shí)進(jìn)行分組處理，采用不同濃度(800、400、200、100、50 μmol/L)H2O2處理細(xì)胞2 h。MTT法考察不同濃度的H2O2溶液對(duì)原代神經(jīng)元活力的影響，從而篩選H2O2最佳造模濃度。

1.5 細(xì)胞分組 將原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞分為五組：空白組、模型組、靜寧顆粒低劑量組(0.2 mg/ml)、靜寧顆粒中劑量組(0.4 mg/ml)、靜寧顆粒高劑量組(0.8 mg/ml)。其中空白組用正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組采用H2O2刺激2 h；各用藥組分別加入上述三種濃度的靜寧顆粒干預(yù)后，再加入H2O2刺激2 h。

1.6 DAPI染色 細(xì)胞培養(yǎng)第9天，按照分組方法處理細(xì)胞后，0.4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3 min×2次，DAPI染色5 min，PBS清洗3 min×2次，置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.7 ROS、MDA、SOD及GSH含量測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)第9天，按照分組方法處理細(xì)胞后，按試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)ROS、MDA、SOD及GSH 的含量。

1.8 Western blot檢測(cè)Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、p53、Bax、Bcl-2及Caspase 3蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)第9天，按照分組方法處理細(xì)胞后，細(xì)胞刮取細(xì)胞，加入蛋白裂解液置于冰上30 min，使其充分裂解，離心(4 ℃，10000 r/min)10 min，吸取上清即為蛋白。然后采用BCA法對(duì)蛋白定量。95 ℃水浴使蛋白變性后，經(jīng) SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。置于含對(duì)應(yīng)一抗的Blotto中，4 ℃搖動(dòng)作用過(guò)夜，漂洗4次后滴加二抗，室溫作用1.5 h。漂洗4次后使用奧德賽儀器進(jìn)行掃膜[8]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài) 原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞在培養(yǎng)4 h左右后基本貼壁，此時(shí)細(xì)胞呈圓形，光暈透亮，有立體感；培養(yǎng)1 d后，部分細(xì)胞出現(xiàn)突觸，多數(shù)以圓形或橢圓形存在；培養(yǎng)至第3天，多數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)出突觸，密度較之前增大；培養(yǎng)至第9天時(shí)，胞體明顯增多，立體感增強(qiáng)，突起更長(zhǎng)且增粗，并交織成網(wǎng)絡(luò)，表明原代皮層神經(jīng)元功能正常(圖1)。

A：培養(yǎng)第1天；B：培養(yǎng)第3天；C：培養(yǎng)第9天

2.2 靜寧顆粒給藥濃度及H2O2造模濃度篩選 根據(jù)MTT結(jié)果顯示，與空白組相比，當(dāng)靜寧顆粒濃度≤0.8 mg/ml時(shí)，對(duì)原代皮層神經(jīng)元無(wú)細(xì)胞毒性；當(dāng)靜寧顆粒濃度為1.6、2.0、2.5 mg/ml時(shí)，細(xì)胞活力分別為39.05%、15.62%、15.84%，低于空白組(P<0.01)。因此，選取濃度為0.8、0.4、0.2 mg/ml的靜寧顆粒溶液作為高中低濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

MTT結(jié)果可知，當(dāng)H2O2濃度為50、100 μmol/L時(shí)，原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞的存活率分別為62%、27%，并且隨濃度增大，存活率降低。用50 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞2 h時(shí)，胞體腫脹變圓，立體感變差，光暈變得不明顯，突起斷裂或消失，有較多細(xì)胞碎片，所交織成的網(wǎng)絡(luò)消失不見(jiàn)。隨著H2O2濃度增加，大量細(xì)胞死亡。見(jiàn)圖2。因此，選取50 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞2 h作為氧化應(yīng)激損傷模型的造模條件。

A：對(duì)照組；B：50 μmol/L H2O2；C：100 μmol/L H2O2；D：200 μmol/L H2O2；E：400 μmol/L H2O2；F：800 μmol/L H2O2

2.3 DAPI染色結(jié)果 由DAPI染色結(jié)果可知，靜寧顆粒低劑量組、靜寧顆粒中劑量組、靜寧顆粒高劑量組均能夠改善H2O2刺激導(dǎo)致的原代神經(jīng)元的細(xì)胞核固縮以及核形狀不規(guī)則，并且能夠減少凋亡小體的出現(xiàn)頻率；另外隨著靜寧顆粒藥物濃度的增加，細(xì)胞核固縮和不規(guī)則程度降低，凋亡小體出現(xiàn)頻率降低，呈現(xiàn)明顯劑量依賴關(guān)系(圖3)。

箭頭指向凋亡細(xì)胞；A：對(duì)照組；B：H2O2模型組；C：靜寧顆粒低劑量組；D：靜寧顆粒中劑量組；E：靜寧顆粒高劑量組

2.4 靜寧顆粒預(yù)處理對(duì)原代皮層神經(jīng)元ROS、MDA、SOD和GSH含量的影響 見(jiàn)表1。與H2O2造模組相比，當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.2、0.4、0.8 mg/ml時(shí)，ROS含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，MDA含量低于模型組(P<0.05)；與H2O2造模組相比，當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，SOD含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，GSH含量高于模型組(P<0.01)。

表1 各組處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元ROS、MDA、SOD、GSH含量的影響(%)

2.5 靜寧顆粒預(yù)處理對(duì)原代皮層神經(jīng)元Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、p53、Bax、Bcl-2及Caspase 3蛋白表達(dá)的影響 Western blot分析結(jié)果顯示，模型組Keap1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)，當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，Keap1蛋白表達(dá)均降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與空白組相比，模型組Nrf2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，Nrf2蛋白表達(dá)高于模型組(P<0.05)。模型組NQO1、HO-1蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01)，當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，NQO1蛋白表達(dá)均升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml時(shí)，HO-1蛋白表達(dá)高于模型組(P<0.01)。因此，以上結(jié)果表明靜寧顆粒能夠修復(fù)H2O2造成的原代皮層神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，見(jiàn)圖4(表2)。

圖4 不同濃度靜寧顆粒對(duì)H2O2誘導(dǎo)的原代皮層

表2 各組處理對(duì)原代皮層神經(jīng)元Keap1、NQO1、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響(%)

由靜寧顆粒對(duì)原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，模型組中促凋亡蛋白p53、Bax、Caspase 3及cleaved-Caspase 3表達(dá)明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.8 mg/ml時(shí)，p53表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)靜寧顆粒濃度為0.4、0.8 mg/ml 時(shí)，Bax、Caspase 3及cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，以上結(jié)果表明靜寧顆粒能夠修復(fù)H2O2造成的原代皮層神經(jīng)元的凋亡損傷，見(jiàn)表3(圖5)。

表3 各組處理對(duì)原代皮層神經(jīng)元p53、Bax、Bcl-2、Caspase 3、cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)的影響

圖5 不同濃度靜寧顆粒對(duì)H2O2誘導(dǎo)的原代皮層

3 討 論

ADHD是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的一種神經(jīng)行為障礙，嚴(yán)重影響患者的學(xué)習(xí)、生活和工作質(zhì)量。中醫(yī)認(rèn)為ADHD是一種心肝有余、脾腎不足的本虛標(biāo)實(shí)證，病機(jī)為氣機(jī)紊亂，久而化熱，耗傷肝陰，肝陰不足而肝陽(yáng)易亢，肝經(jīng)有熱，肝火亢盛，火動(dòng)生風(fēng)，則出現(xiàn)性情暴躁，多動(dòng)任性等癥狀。目前，中醫(yī)藥治療ADHD多以滋腎平肝、調(diào)和陰陽(yáng)、安神益智、豁痰開(kāi)竅為主，進(jìn)而發(fā)揮治療ADHD的作用[9]。靜寧顆粒由太子參、熟地黃、五味子、枸杞子、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓共七味藥組成，符合元代李東垣所說(shuō)：“主病之為君，兼見(jiàn)何病，則以佐使藥分治之，此制方之要也”的原則。方中太子參性平，味甘微苦，補(bǔ)氣潤(rùn)肺、生津健脾，熟地黃味甘微溫，補(bǔ)血滋陰、填精生髓共為君藥；五味子補(bǔ)腎寧心，枸杞子滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)血安神共為臣藥；遠(yuǎn)志味苦辛，性溫，安神益智，石菖蒲開(kāi)竅豁痰、醒神益智，茯苓味甘淡，性平，健脾益氣、安神共為佐使藥。諸藥合用，治療氣陰兩虛證的ADHD。

ADHD大腦皮層是調(diào)節(jié)軀體運(yùn)動(dòng)或者說(shuō)控制軀體運(yùn)動(dòng)的最高級(jí)中樞，而ADHD的發(fā)生與大腦皮層有關(guān)[10-11]。通過(guò)神經(jīng)影像學(xué)發(fā)現(xiàn)ADHD患者的前額、基底節(jié)和胼胝體存在著大腦皮層體積的異常且已有證明前額葉的體積減小與反應(yīng)機(jī)制損傷有關(guān)[12-13]。這都與ADHD注意力不集中、多動(dòng)、沖動(dòng)性的特征一致。本文選取原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞，H2O2造成氧化損傷，從氧化應(yīng)激方面探討靜寧顆粒治療ADHD的機(jī)制。

Keap1/Nrf2-ARE信號(hào)通路是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，它能夠抵抗各種體內(nèi)外刺激所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在機(jī)體的防御中發(fā)揮重要作用[14-16]。本研究中，模型組Keap1蛋白表達(dá)明顯升高，而Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低，說(shuō)明H2O2造模后Keap1表達(dá)增加，Nrf2活化被抑制，導(dǎo)致Nrf2激活障礙，說(shuō)明神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生與Keap1/Nrf2信號(hào)通路調(diào)控異常有關(guān)。靜寧顆粒給藥后Keap1蛋白表達(dá)降低，Nrf2的表達(dá)升高。說(shuō)明靜寧顆粒給藥后能夠調(diào)控Nrf2的激活，激活的Nrf2與Keap1解離入核，與抗氧化反應(yīng)元件相結(jié)合，進(jìn)一步引發(fā)HO-1、NQO1等蛋白表達(dá)發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的作用，從而保護(hù)原代神經(jīng)元細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

線粒體依賴途經(jīng)誘導(dǎo)的凋亡起始于線粒體，并被內(nèi)源性ROS調(diào)控，引發(fā)細(xì)胞凋亡[17-18]。已有研究表明，p53能夠通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax等凋亡相關(guān)蛋白引發(fā)凋亡[19-20]。另外，抑制凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比值被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的“分子開(kāi)關(guān)”[21]。由結(jié)果可知，H2O2造模后，p53、Bax、Caspase 3、cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。靜寧顆粒保護(hù)后，p53、Bax、Caspase 3、cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高。

本研究表明了靜寧顆粒對(duì)H2O2所致小鼠原代皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，可改善細(xì)胞損傷后形態(tài)，該過(guò)程與Keap1/Nrf2氧化應(yīng)激通路和Caspase依賴的線粒體通路有關(guān)。多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，該研究為靜寧顆粒在神經(jīng)疾病中的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。