譚婕，李芃，王洪星

股骨頭壞死又稱股骨頭缺血性壞死，因多種因素導(dǎo)致股骨頭缺血障礙，從而導(dǎo)致軟骨下區(qū)的軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞得不到所需的營養(yǎng)物質(zhì)而壞死，并伴隨局部骨質(zhì)疏松，最終因外力作用或者意外傷導(dǎo)致股骨頭塌陷[1]。股骨頭壞死病因復(fù)雜，治療困難，嚴(yán)重影響患者日常生活，是成年人致殘的重要原因之一。關(guān)于股骨頭壞死的保髖治療方案，藥物治療非常廣泛，但目前沒有一種藥物治療方案療效顯著[2]，查閱過去報道來看，二膦酸鹽類(如阿侖膦酸鈉)能有效調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能、阿托伐他汀藥物能有效調(diào)節(jié)脂類代謝異常、肝素能有效調(diào)節(jié)凝血功能、維生素E參與氧化應(yīng)激類藥物、1,25-(OH)-D3和維生素K等參與骨代謝，均對股骨頭壞死有防治作用[3-4]，中藥對股骨頭壞死的治療作用也日益受到重視[5-7]?；谏飳W(xué)及基因研究證實，PI3K、AKT信號通路可對血管修復(fù)再生、成骨細(xì)胞分化增殖凋亡與破骨細(xì)胞分化相關(guān)因素進(jìn)行有效調(diào)控。因此通過檢測PI3K、AKT基因表達(dá)水平以及蛋白表達(dá)水平，可對藥物的有效性進(jìn)行量化評估?，F(xiàn)觀察加味陽和湯對陽虛寒凝型酒精性股骨頭壞死大鼠PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)水平的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康8周齡雄性Wistar大鼠33只，體質(zhì)量為(290±20)g，由吳氏動物提供，全部大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料高籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實行12 h/12 h間斷照明。室溫控制在(24±2)℃。試劑與藥品：中藥湯劑由福州市中醫(yī)院煎藥房制備，藥物濃度1 g/ml。復(fù)方骨肽注射液(南京新百藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H32020004，規(guī)格：5 ml∶75 mg/瓶)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 陽虛寒凝型酒精性股骨頭壞死模型建立：采用冷固法復(fù)合酒精灌胃復(fù)制陽虛寒凝型酒精性股骨頭壞死模型。造模第1周。采用含體積分?jǐn)?shù)46%酒精灌胃[8]，灌胃量約10 ml·kg-1·d-1，造模周期24周(相當(dāng)于正常成年人每日飲酒500～800 ml，連續(xù)飲用10余年)；同時，每日8:00將大鼠放入沒過大鼠髖關(guān)節(jié)的(6±0.5)℃的冰水6 h。6 h后，固定大鼠雙下肢，至次日8:00，如此反復(fù)。24周時，隨機處死9只大鼠，觀察股骨頭形態(tài)、滑膜，計算空骨陷窩百分比[9]，判定股骨頭壞死模型建模成功，開始分組給藥。

1.2.2 分組 建模成功后，將24只大鼠隨機分為空白對照組、治療組1、治療組2，每組8只。

1.2.3 給藥方法 根據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》實驗動物用藥劑量換算原則，大鼠給藥劑量(mg/kg)=6.25×人服藥劑量(mg/kg)。治療組1予復(fù)方骨肽注射液肌肉注射，14.38 mg/kg，1次/d，連續(xù)治療4周。治療組2予加味陽和湯灌胃[組方：熟地30 g，鹿角膠6 g，姜炭2 g，肉桂(去皮，研粉)3 g，白芥子6 g，麻黃2 g，生甘草3 g，土鱉蟲10 g、蜂房5 g、續(xù)斷10 g、骨碎補10 g]，2次/d，水煎煮，灌胃給藥，持續(xù)治療4周。空白對照組僅予以0.9%氯化鈉溶液，持續(xù)4周，

1.3 觀察指標(biāo)與方法 治療后通過RT-PCR及Western-Blotting檢測PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)水平。比較3組PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)水平。(1)RT-PCR檢測：選擇美國ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，選取20 μl作為研究的擴增體系，試驗相關(guān)條件即為：在95 ℃下進(jìn)行5 min 1次的循環(huán)；95 ℃、20 s，60 ℃、40 s，進(jìn)行40次循環(huán)；從65～95 ℃以0.5 ℃進(jìn)行遞增。依據(jù)2-ΔΔCT計算PI3K、AKT基因相對表達(dá)量，每組有3個復(fù)孔開展3次重復(fù)試驗。(2)Western-Blotting檢測：以常規(guī)方法對總蛋白進(jìn)行提取，于-80 ℃冰箱中進(jìn)行存儲。選取總蛋白樣本實施SDS-PAGE凝膠電泳處理，在冰浴下通過80 V電壓轉(zhuǎn)到PVDF膜，經(jīng)1.5 h處理。在通過PBST緩沖液進(jìn)行3次洗膜后實施1.5 h封閉。完成剪膜加入一抗以4 ℃下進(jìn)行孵育過夜，大鼠抗人PI3K抗體、大鼠抗人AKT抗體的稀釋比例均為1∶1 000。第2日復(fù)溫，通過PBST搖擺進(jìn)行3次清洗后進(jìn)行二抗，于室內(nèi)溫度下進(jìn)行60 min孵育，收集條帶結(jié)果通過凝膠成像分析，以Image J軟件實施量化分析。

2 結(jié) 果

2.1 PI3K、AKT基因表達(dá)水平 PI3K、AKT基因表達(dá)水平空白對照組低于治療組1低于治療組2(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠PI3K、AKT基因表達(dá)水平比較

2.2 PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平 PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平空白對照組低于治療組1低于治療組2(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 3組大鼠PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較

圖1 3組大鼠PI3K、AKT通路對應(yīng)蛋白表達(dá)水平印跡圖

3 討 論

研究證實，PI3K、AKT信號通路可對血管再生及修復(fù)中的關(guān)鍵因素進(jìn)行調(diào)控[10]，如血管生成素、血管內(nèi)皮生長因子、一氧化氮、缺氧誘導(dǎo)因子等。PI3K、AKT信號的增強可以調(diào)控Wnt/β-catenin通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白與叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O信號通路[11-16]，從而影響成骨細(xì)胞的分化凋亡，引起成骨細(xì)胞增殖、延緩其凋亡時間[17]。PI3K、AKT可對RANKL通路、腫瘤壞死因子α、microRNA/P ten通路進(jìn)行調(diào)控，通過抑制破骨細(xì)胞增殖來維持骨代謝平衡[18-20]。所以，通過檢測PI3K、AKT基因的表達(dá)強度，能夠?qū)λ幬锘蛑委煼桨傅挠行赃M(jìn)行量化評估。

在長期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，陽虛寒凝型股骨頭壞死主要表現(xiàn)為髖關(guān)節(jié)疼痛、拘攣、屈伸不利或伴有下肢沉重、肢體麻木等，根據(jù)“寒為陰邪、損傷陽氣”“寒性凝滯、寒主收引”“寒凝血瘀、不通則痛”觀點，其致病乃“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹”。正如《內(nèi)經(jīng)》所云:“惡血在內(nèi)而不去，卒然喜怒不節(jié)，飲食不適，寒溫不時，腠理閉而不通，其開而遇風(fēng)寒，則氣血凝結(jié)，外邪相襲，則為痹痛”。根據(jù)上述機制，中藥治療陽虛寒凝型酒精性股骨頭壞死，當(dāng)著眼于溫陽、散寒、活血、通絡(luò)、祛濕等。大量文獻(xiàn)表明，溫陽散寒、活血祛濕、舒筋止痛類中藥在血管內(nèi)皮生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β等因素上均有明確效應(yīng)[15-18]。

本研究應(yīng)用的加味陽和湯在原方熟地30 g，鹿角膠6 g，姜炭2 g，肉桂(去皮，研粉)3 g，白芥子6 g，麻黃2 g，生甘草3 g的基礎(chǔ)上，添加土鱉蟲10 g、蜂房5 g、續(xù)斷10 g、骨碎補10 g，加強活血祛濕通絡(luò)功效。方中以熟地、鹿角膠為君藥，滋補陰血、填精益髓、補腎助陽，借助血肉有情之物，補益精元，使陽氣生化有源，此為“陰中求陽”之法。臣藥為肉桂、姜炭，溫陽散寒通脈。因寒凝濕滯，非溫通不足以化。佐藥為麻黃、白芥子，開腠理、祛痰濕，以宣散體表之寒凝，且宣通氣血。又令熟地黃、鹿角膠共為佐藥，補而不滯。生甘草為使藥，解毒、調(diào)和諸藥。配合藥對蜂房、土鱉溫腎通絡(luò)，續(xù)斷、骨碎補強筋壯骨?？v觀全方，溫陽藥與補陰藥合用，辛散藥與滋補藥配伍，活血通絡(luò)、健脾祛濕，使寒濕得宣而不傷正，精血得充而不戀邪，可化陰凝而布陽和。在臨床的觀察中，通過口服中藥，配合保護性負(fù)重及針對性關(guān)節(jié)鍛煉，可以有效緩解患髖疼痛、屈伸受限及下肢酸楚無力等問題。但對于評估是否能有效延緩病程，仍缺乏量化指標(biāo)及長期跟蹤隨訪。

本實驗采用加味陽和湯治療陽虛寒凝型酒精性股骨頭壞死大鼠，通過對3組大鼠給藥后PI3K、AKT基因表達(dá)水平以及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，治療組PI3K、AKT基因表達(dá)水平以及蛋白表達(dá)水平均優(yōu)于空白對照組，且治療組2較治療組1各指標(biāo)改善更顯著，表明加味陽和湯可調(diào)控PI3K、AKT基因及蛋白表達(dá)水平。但由于PI3K、AKT可通過調(diào)控糖原合成激酶3β發(fā)揮作用，且糖原合成激酶3β磷酸化表達(dá)水平并不是越高越有利于成骨細(xì)胞分化[1]。有研究證實高水平的糖原合成激酶3β會抑制干細(xì)胞在股骨頭壞死中的分化，并造成β-catenin減少，并且在大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立中發(fā)現(xiàn)，過多糖原合成激酶3β磷酸化表達(dá)可加快成骨細(xì)胞的凋亡[9]。因此PI3K、AKT在自身促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時，也可通過糖原合成激酶3β實現(xiàn)與Wnt/β-catenin的鏈接從而加強成骨細(xì)胞的分化增殖，但需對把控糖原合成激酶3β磷酸化含量引起重視。關(guān)于此方面的研究，目前尚缺乏有價值的數(shù)據(jù)進(jìn)行評估判定，關(guān)于PI3K、AKT表達(dá)水平的拐點如何測定，將在后期的實驗中進(jìn)一步觀察。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。