肖遙 傅強(qiáng) 趙進(jìn)喜 孫瑞茜 黃為鈞 劉軼凡 劉媛媛

摘要 目的：應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法篩選“人參-黃連-三七”藥串治療2型糖尿病胰島素抵抗合并非酒精性脂肪肝的作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確其療效與作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索獲取“人參-黃連-三七”的主要化學(xué)成分以及相關(guān)作用靶點(diǎn);使用DisGeNET篩選胰島素抵抗與非酒精性脂肪肝的相關(guān)靶標(biāo)基因;通過韋恩軟件篩選出藥物與疾病的共同作用靶點(diǎn);構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò);通過基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析對(duì)有效作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析;以db/db小鼠作為動(dòng)物模型，檢測小鼠血糖、胰島素水平，并通過肝臟HE染色及免疫組織化學(xué)法進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果：通過篩選得到“人參-黃連-三七”藥串有效成分39種，有效作用靶點(diǎn)125個(gè)，其中作用于胰島素抵抗與非酒精性脂肪肝的相關(guān)靶點(diǎn)27個(gè);分子功能共富集211個(gè)條目，生物過程共富集2 317個(gè)條目，細(xì)胞組分共富集105個(gè)條目;KEGG通路富集共富集到119條信號(hào)通路，其中包括AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證“人參-黃連-三七”藥串水煎劑能夠有效降低db/db小鼠血糖，改善胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性。與模型組比較，中藥組小鼠血糖、胰島素抵抗指數(shù)下降（P<0.05），肝臟NAS評(píng)分較模型組明顯下降（P<0.05），免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，中藥組小鼠肝臟PI3K、p-AKT表達(dá)水平較模型組明顯上升（P<0.05）。結(jié)論：“人參-黃連-三七”藥串能夠有效改善db/db小鼠胰島素抵抗并減輕非酒精性脂肪肝病變，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);胰島素抵抗;非酒精性脂肪肝;人參-黃連-三七

Abstract Objective：To screen therapeutic targets and associated signaling pathways of “Ginseng & Coptis chinensis & Pseudo-ginseng” compound in the treatment of type 2 diabetic insulin resistance combined with non-alcoholic fatty liver disease by employing network pharmacology method and to clarify its efficacy and mechanism through animal experiments.Methods：The main chemical components and related action targets of “Ginseng & Coptis chinensis & Pseudo-ginseng” compound were retrieved by using TCMSP database.DisGeNET was used to screen the target genes related to insulin resistance and nonalcoholic fatty liver.The common action targets of drugs and diseases were screened by Venn software.Then a ‘diseases-targets-components-drugs’ network and constructed the protein-protein interaction network（PPI） were built.The effective targets were analyzed by Gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of genes and genomes（KEGG） pathway enrichment analysis.Finally，the levels of serum glucose and insulin in db/db mice were measured，and the effective targets and signaling pathway by liver HE staining and immunohistochemistry were verified.Results：A total of 39 effective components and 125 effective targets of “Ginseng & Coptis chinensis & Pseudo-ginseng” compound were screened，including 27 target relating to insulin resistance and nonalcoholic fatty liver; through GO enrichment analysis，211 entries were enriched in molecular function，2317 entries in biological process and 105 entries in cell components; KEGG pathway was enriched to 119 signaling pathways，including AGE-RAGE signaling pathway，HIF-1 signaling pathway，PPAR signaling pathway，PI3K/AKT signaling pathway，etc.Through animal experiments，it was verified that “Ginseng & Coptis chinensis & Pseudo-ginseng” compound could effectively reduce FBS，relieve insulin resistance and reduce liver steatosis in db/db mice.Compared with the model group，the FBS and HOMA-IR index of compound treatment group decreased（P<0.05），and the liver NAS score decreased significantly（P<0.05）.The results of immunohistochemical staining showed that the expression levels of PI3K and p-AKT in the liver of compound treatment group increased significantly（P<0.05）.Conclusion：“Ginseng & Coptis chinensis & Pseudo-ginseng” compound can effectively relieve insulin resistance and reduce nonalcoholic fatty liver disease in db/db mice，and its mechanism may be related to the regulation of PI3K/AKT signaling pathway.

Keywords Network pharmacology;Insulin Resistance;Non-alcoholic Fatty Liver Disease;Ginseng & Coptis chinensis & Pseudo-ginseng

中圖分類號(hào)：R285;R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.005

近年來，在2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者中胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）合并非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）的比例顯著增高，研究顯示超過76%的2型糖尿病患者患有NAFLD[1]。IR是2型糖尿病的主要特征，而肝臟是糖脂代謝的主要部位，也是發(fā)生IR的主要靶器官之一，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。肝臟的脂肪變性被與肝臟IR密切相關(guān)，IR能夠誘發(fā)NAFLD，而當(dāng)脂肪在肝臟中過多堆積時(shí)不僅可以誘發(fā)機(jī)體糖脂代謝紊亂加重IR，還能夠通過炎癥等途徑進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞的胰島素敏感性進(jìn)一步下降[2]，從而加速疾病的進(jìn)展。

中醫(yī)藥具有“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)，在治療2型糖尿病IR合并NAFLD方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。國醫(yī)大師呂仁和教授根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“肝脆，則善病消癉易傷”理論認(rèn)為，肝之疏泄功能失常與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，因此臨床上糖尿病胰島素抵抗患者多伴見脂肪肝表現(xiàn)。呂仁和教授以“益氣清熱活血”治法作為臨床治療2型糖尿病IR合并NAFLD的基本治法，并提出以“人參-黃連-三七”藥串作為基本方，在臨床上獲得了較好療效。但目前學(xué)界對(duì)于“人參-黃連-三七”藥串的作用機(jī)制研究仍有不足，因此本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法篩選出“人參-黃連-三七”藥串的有效成分，進(jìn)一步構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)圖，探討該藥串改善IR合并NAFLD相關(guān)作用機(jī)制并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 藥物關(guān)鍵化合物的篩選

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/）檢索出人參、黃連、三七的主要有效化學(xué)成分，再對(duì)3藥的化學(xué)成分進(jìn)行口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）以及類藥性（Drug Likeness，DL）篩選，設(shè)置篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18。

1.2 化合物關(guān)鍵靶點(diǎn)疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

利用TCMSP檢索人參、黃連、三七化合物的關(guān)鍵作用靶標(biāo)基因，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）檢索出靶標(biāo)基因?qū)?yīng)人類基因的名稱?；诨?疾病關(guān)聯(lián)評(píng)分≥0.3為篩選條件，IR合并NAFLD相關(guān)疾病的靶標(biāo)基因通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https：//Disgenet.org/）檢索獲得。

1.3 構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)及可視化分析

利用韋恩在線軟件選取藥物與疾病共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖，利用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化分析。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選得到的藥物-疾病共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選出靶點(diǎn)基因。

1.5 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

將“人參、黃連、三七”的靶蛋白上傳到DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），通過分析了解“人參、黃連、三七”藥串的有效成分對(duì)于IR合并NAFLD的基因本體（Gene Ontology，GO）功能，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析找到相關(guān)靶標(biāo)在通路中的分布情況，直接觀察到“人參-黃連-三七”藥串作用于IR合并NAFLD的主要機(jī)制途徑。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 材料

2.1.1 動(dòng)物 6周齡雄性db/db小鼠及對(duì)照db/m小鼠，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度（24±2）℃，12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由攝食、飲水。

2.1.2 藥物 黃連30 g、人參3 g、三七粉6 g（藥物均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，生產(chǎn)批號(hào)：19080501）。黃連、人參飲片加入500 mL去離子水浸泡30 min后，以煎藥鍋武火檔煮沸，煮沸后換文火檔煎藥30 min，將煎煮完畢的藥液倒出，再加入300 mL去離子水，以武火檔煮沸，煮沸后換文火檔煎藥30 min，將煎煮完畢的藥液倒出與第一次煎煮完畢的藥液混合，加入三七粉6 g充分溶解，過濾并棄去藥渣后繼續(xù)煎煮將藥液濃縮。濃縮后的藥液置于冷凍干燥機(jī)中干燥脫水成粉末狀，制成凍干粉-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 試劑與儀器 PI3K抗體（abcam公司，英國，批號(hào)：ab135253）;p-AKT抗體（abcam公司，英國，批號(hào)：ab81283）;小鼠胰島素檢測試劑盒（abcam公司，英國，批號(hào)：ab277390）;兔免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（PV-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 分組與模型制備 所有動(dòng)物在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后編號(hào)、稱重、測定空腹血糖，db/db小鼠以血糖作為分層標(biāo)準(zhǔn)再隨機(jī)分為模型組、中藥組，db/m小鼠作為空白對(duì)照，每組小鼠8只。但飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)小鼠咬傷感染死亡，最后剩余空白組7只，模型組6只和中藥組6只。限于經(jīng)費(fèi)等原因，IHC和HE是每組中隨機(jī)選擇了4～5只小鼠進(jìn)行檢測。

2.2.2 給藥方法 所有小鼠在分組1周后開始進(jìn)行藥物干預(yù)，空白組與模型組給予10 mL/（kg·d）去離子水灌胃，中藥組給予10 mL/（kg·d）“人參、黃連、三七”藥串水煎劑灌胃。各組均灌胃1次/d，灌胃給藥8周，根據(jù)人和動(dòng)物藥物劑量換算，實(shí)驗(yàn)用小鼠給予人體臨床等效劑量9.1倍藥量：黃連4.55 g/kg、人參0.455 g/kg、三七0.91 g/kg。

2.2.3 檢測指標(biāo)與方法

2.2.3.1 血糖、體質(zhì)量及胰島素檢測 在第2、4、8周分別稱體質(zhì)量并測定血糖。檢測前小鼠禁食6 h，其間自由飲水。檢測時(shí)讀取2次血糖平均指數(shù)。各組動(dòng)物于給藥8周后取材，取材前禁食水12 h，在1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下，摘眼取血，血液在采血管中靜置2 h后，4 ℃，1 000 ×g，離心15 min。離心后取上層血清置于1.5 mL EP管中，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)血清中胰島素水平進(jìn)行檢測，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。

2.2.3.2 肝臟病理檢查 小鼠肝組織置于10%多聚甲醛固定液中固定，石蠟包埋后進(jìn)行HE染色并在光鏡下觀察肝臟病理改變。每組隨機(jī)選取6張切片，采用NAS半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)肝臟脂肪病變程度進(jìn)行判定。

2.2.3.3 免疫組織化學(xué)法檢測PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 小鼠肝組織經(jīng)固定、石蠟包埋后，切片機(jī)切成2 μm切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷、3%過氧化氫阻斷、山羊血清封閉后取PI3K、p-AKT一抗（1∶250）在濕盒中孵育4 ℃過夜，隨后經(jīng)PBS泡洗、二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染反藍(lán)、脫水、透明后，使用中性樹膠進(jìn)行封片，隨后在光鏡下進(jìn)行觀察、拍照后，采用ImageJ測定免疫組織化學(xué)陽性區(qū)域光度值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組數(shù)據(jù)比較首先判斷其是否符合正態(tài)分布，若符合正態(tài)分布則進(jìn)行t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布則進(jìn)行秩和檢驗(yàn);3組及以上數(shù)據(jù)首先檢測其方差齊性，方差齊性采用Levene檢驗(yàn)方法，組間比較采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，若方差齊則采用LSD檢驗(yàn)比較組間差異，若方差不齊則采用新復(fù)極差法（Dunnett′T3）檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參、黃連、三七藥物有效化學(xué)成分

基于OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共獲取39種有效化學(xué)成分，其中人參22種，黃連14種，三七8種，人參、三七中均含有β-谷甾醇、豆甾醇、鄰苯二甲酸二異辛酯、人參皂苷Rh2成分，黃連、三七均含有槲皮素成分。見表1。

3.2 藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)

基于DisGeNET數(shù)據(jù)庫，共檢索出相關(guān)靶點(diǎn)125個(gè)，將藥物活性成分對(duì)應(yīng)的215個(gè)藥物靶點(diǎn)與125個(gè)疾病靶點(diǎn)獲取交集，通過韋恩圖交集得到27個(gè)共同靶點(diǎn)。見圖1。

3.3 “疾病-靶點(diǎn)-成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將39種有效成分與27個(gè)共同靶點(diǎn)構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-成分-藥物”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。其中橙色菱形代表藥物，黃色矩形代表藥物活性成分，藍(lán)色矩形代表交集靶點(diǎn)，綠色三角形代表疾病，每條邊表示各節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。見圖2。

3.4 藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

從韋恩圖中獲得27個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步得到PPI網(wǎng)絡(luò)。共涉及27個(gè)節(jié)點(diǎn)274條邊，節(jié)點(diǎn)表示成分與靶點(diǎn)，邊表示二者之間相互作用。見圖3。各靶點(diǎn)按與其相關(guān)的節(jié)點(diǎn)數(shù)目（Degree）進(jìn)行排序，結(jié)果顯示TNF、EGFR、PPARG、PPARA、PTEN、NOS3、HMOX1、NFE2L2、CCL2與其他靶點(diǎn)相互作用較強(qiáng)，可能在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵作用。見表2。

3.5 人參-黃連-三七藥串治療IR合并NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)通路富集分析

3.5.1 GO富集分析 通過GO富集分析在分子功能（Molecular Function，MF）方面共富集211個(gè)條目，在生物過程（Biological Process，BP）方面共富集2 317個(gè)條目，在細(xì)胞組分（Cell Component，CC）方面共富集105個(gè)條目。其中“人參、黃連、三七”藥串治療IR合并NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及的分子功能主要包括核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性（Ligand-activated Transcription Factor Activity）、脂肪酸結(jié)合（Fatty Acid Binding）、長鏈脂肪酸結(jié)合（Long-chain Fatty Acid Binding）等;在生物過程方面主要涉及活性氧代謝過程（Reactive Oxygen Species Metabolic Process）、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)（Cellular Response to Lipid）、凋亡信號(hào)通路（Apoptotic Signaling Pathway）等;在細(xì)胞組分方面主要影響膜筏（Membrane Raft）、膜微區(qū)（Membrane Microdomain）、質(zhì)膜筏（Plasma Membrane Raft）等組分。根據(jù)P值從小到大排序，選取各模塊排名前20結(jié)果分別繪制柱狀圖。見圖4。

3.5.2 KEGG通路富集分析 以P≤0.05的項(xiàng)目為有顯著差異的通路，共富集到119條信號(hào)通路，其中包括AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等，基于P≤0.01的條件，在查閱文獻(xiàn)后進(jìn)一步對(duì)相關(guān)通路進(jìn)行篩選，選取排名前30的通路繪制氣泡圖。見圖5。

3.6 人參-黃連-三七藥串干預(yù)db/db小鼠實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

3.6.1 各組小鼠血糖水平比較

0周、4周、8周時(shí)，模型組、中藥組小鼠血糖較空白組均顯著上升（P<0.01），模型組、中藥組小鼠在0周血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4周、8周時(shí)中藥組小鼠血糖水平較模型組下降（P<0.05）。見表3。

3.6.2 各組小鼠血清胰島素水平及HOMA-IR比較

與空白組比較，模型組和中藥組小鼠血清胰島素水平均顯著升高（P<0.01），模型組與中藥組小鼠血清胰島素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組及中藥組小鼠HOMA-IR均較空白組顯著上升（P<0.01），中藥組小鼠HOMA-IR較模型組顯著下降（P<0.01）。見表4。

3.6.3 各組小鼠肝臟病理結(jié)果

肝臟組織經(jīng)HE染色后，光鏡下可見空白組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，模型組小鼠可見較為明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，大量肝細(xì)胞空泡性改變、細(xì)胞脫落表現(xiàn)。見圖6。模型組db/db小鼠NAS評(píng)分較空白組顯著升高（P<0.01），經(jīng)中藥干預(yù)后，中藥組db/db小鼠肝臟脂肪變性明顯減輕，NAS評(píng)分較模型組降低（P<0.05）。見表5。

3.6.4 各組小鼠肝臟PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，PTEN同時(shí)是中藥“人參、黃連、三七”藥串調(diào)控IR與NAFLD的交集靶點(diǎn)之一，而PTEN同時(shí)也是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與了營養(yǎng)代謝、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生物途徑。提示PI3K/AKT信號(hào)通路可能在IR與NAFLD的發(fā)生過程中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，因此在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中我們通過免疫組織化學(xué)染色對(duì)小鼠肝臟PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。見圖7。

與空白組比較，模型組小鼠肝組織PI3K、p-AKT水平表達(dá)明顯減少（P<0.05），經(jīng)中藥組干預(yù)后db/db小鼠肝組織中PI3K、p-AKT水平表達(dá)明顯增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明“人參、黃連、三七”藥串能夠通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路從而改善肝臟胰島素抵抗。見表6。

4 討論

《素問·奇病論篇》有“有病口甘者……故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”等有關(guān)論述。國醫(yī)大師呂仁和教授將糖尿病歸于中醫(yī)學(xué)“消渴病”的范疇，并根據(jù)其發(fā)展階段將之分為脾癉、消渴、消癉3期[4]。我們認(rèn)為，“熱傷氣陰”是糖尿病的基本病機(jī)，消渴病發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的痰濁、瘀血、氣滯等在絡(luò)脈中相互膠結(jié)形成“微型癥瘕”是消渴病發(fā)展變化的主要因素，其發(fā)生發(fā)展具有“熱傷氣陰→氣陰兩虛→絡(luò)脈瘀結(jié)”的變化規(guī)律[5]。而肝為血海，主疏泄，主藏血，其疏泄功能失常不僅會(huì)導(dǎo)致氣血瘀滯，瘀血內(nèi)生，還會(huì)導(dǎo)致痰濁內(nèi)停郁積于肝，從而進(jìn)一步加重疾病發(fā)展。

“人參-黃連-三七”藥串是在“人參-黃連”藥對(duì)的基礎(chǔ)上，加用活血化瘀藥的代表藥物三七而來。這些藥物在改善2型糖尿病IR和NAFLD方面均可以取得良好的療效，如人參及其提取物能夠通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c），并且能夠通過AMPK信號(hào)通路抑制SREBP-1c和SREBP-2的核轉(zhuǎn)位及靶基因的表達(dá)抑制肝脂肪變性和IR[6-8]，人參的提取物還能通過抑制核因子κB信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，從而改善IR并減緩NAFLD進(jìn)展[9-10]。黃連水煎劑能夠通過調(diào)節(jié)胰島素分泌、糖脂代謝、胰高血糖素樣肽-1、體內(nèi)炎癥介質(zhì)以及腸道菌群等途徑保護(hù)胰島功能[11-12]，并能夠通過多種途徑抑制炎癥與抗氧化應(yīng)激相關(guān)通路、激活自噬相關(guān)mTOR信號(hào)通路、調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)FXR/LXR信號(hào)通路等方式起到治療NAFLD的作用[13]。三七水提物及其有效成分能夠通過多種途徑改善IR與NAFLD[14-16]，如三七總皂苷能夠調(diào)節(jié)總SOD水平抑制氧化應(yīng)激損傷[17-18]、抑制肝臟組織炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α釋放、調(diào)節(jié)核因子κB信號(hào)通路等途徑改善IR與NAFLD，并能夠通過調(diào)節(jié)肝臟中CRTC2和SREBP1c蛋白表達(dá)水平減輕肝臟脂肪變性程度[19-21]。本研究通過檢索數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，“人參-黃連-三七”藥串治療IR合并NAFLD的有效化學(xué)成分主要包括山柰酚、槲皮素、人參皂苷rh2、小檗堿、脫氧三尖形酯堿、鄰苯二甲酸二異辛酯等共39種，其中β-谷甾醇、豆甾醇、鄰苯二甲酸二異辛酯、人參皂苷Rh2成分在人參、三七中均含有，槲皮素成分在黃連、三七均含有。人參、黃連、三七這3種藥物中含有的相同或不同化合物均有改善IR、減輕肝臟脂肪變性的作用，因此三藥聯(lián)合應(yīng)用能夠取得更加顯著的臨床效果。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于大數(shù)據(jù)與人工智能，能夠從整體層面出發(fā)，系統(tǒng)地解析藥物及治療對(duì)象之間分子關(guān)聯(lián)規(guī)律的新型研究方法，在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛用于中藥方劑配伍規(guī)律分析、整體作用機(jī)制的闡釋以及潛在藥物靶點(diǎn)成分的預(yù)測等方面[22]。本研究通過對(duì)篩選得出的疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，發(fā)現(xiàn)TNF、EGFR、PPARG、PPARA、PTEN等靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的相互作用。TNF是一種由巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能夠與TNFRs相結(jié)合，直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，研究表明TNF能夠通過抑制胰島素誘導(dǎo)的IRS1酪氨酸磷酸化和葡萄糖攝取，促進(jìn)脂肪細(xì)胞中GKAP42蛋白降解，從而引起IR與NAFLD[23]。EGFR是EGF家族的受體酪氨酸激酶結(jié)合配體，能夠與EGF、TGFA、AREG等多個(gè)配體相結(jié)合從而激活多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)，將細(xì)胞外的信號(hào)刺激轉(zhuǎn)化為特定的細(xì)胞反應(yīng)[24]，從而激活多種與IR和NAFLD相關(guān)的信號(hào)通路，如RAS信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、PLCγ/PKC信號(hào)通路、STATs模塊以及核因子κB信號(hào)通路等[25-26]。PPARA與PPARG同屬過氧化物酶體增殖劑激活受體，是一類核激素受體家族中的配體激活受體，能夠調(diào)節(jié)脂肪酸的過氧化物酶體β途徑，是脂代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在IR與NAFLD的形成中具有關(guān)鍵作用[27-28]。PTEN是一種腫瘤抑制因子，能夠令磷酸肌醇去磷酸化從而拮抗PI3K/AKT信號(hào)通路，并在非磷酸化形式與MAGI2協(xié)同抑制AKT1激活[29]，PTEN是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，參與了營養(yǎng)代謝、炎癥反應(yīng)等多個(gè)生物途徑?；诒狙芯康摹凹膊?靶點(diǎn)-成分-藥物”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，我們發(fā)現(xiàn)PPARA、PTEN同時(shí)也是IR與NAFLD的交集靶點(diǎn)之一，提示二者在IR與NAFLD的發(fā)生過程中可能具有重要作用。

本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)“人參-黃連-三七”藥串治療IR合并NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)在分子功能方面主要以調(diào)節(jié)核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、脂肪酸結(jié)合、長鏈脂肪酸結(jié)合等功能為主;在生物過程方面主要涉及調(diào)控活性氧代謝過程、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路等方面;在細(xì)胞組分方面主要影響膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜筏等組分。KEGG通路富集分析提示“人參-黃連-三七”藥串治療IR合并NAFLD主要是通過AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路等發(fā)揮作用。在肝臟細(xì)胞中，晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的形成能夠同糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）相結(jié)合引起氧化應(yīng)激的發(fā)生，激活核因子κB等一系列信號(hào)通路引起肝臟細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而加重IR與NAFLD[30]。HIF-1信號(hào)通路是動(dòng)物細(xì)胞的一種對(duì)氧氣感知和反應(yīng)的信號(hào)通路，低氧狀態(tài)下HIF-1信號(hào)通路能夠被激活，從而激活編碼參與低氧穩(wěn)態(tài)反應(yīng)蛋白質(zhì)的基因，并誘導(dǎo)控制葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖和血管形成的蛋白質(zhì)表達(dá)[31]，如促進(jìn)血管生成的VEGF、激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的GLUT1、參與糖酵解途徑的LDHA、促進(jìn)紅細(xì)胞生成的EPO等[32]，當(dāng)HIF-1信號(hào)通路下調(diào)時(shí)能夠通過調(diào)節(jié)PPARγ改善脂代謝異常并減輕NAFLD癥狀[33-34]。PPARs是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體，屬于核激素受體家族中的配體激活受體。PPARs具有3種不同亞型[35]，PPARα通過調(diào)節(jié)參與肝臟和骨骼肌脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)，在清除循環(huán)或細(xì)胞脂質(zhì)中發(fā)揮作用;PPARβ/δ參與脂質(zhì)氧化和細(xì)胞增殖;PPARγ促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化以增強(qiáng)血糖攝取。PPAR信號(hào)通路能夠被ERK1/2、p38-MAPK、PKA、PKC、AMPK和GSK3等的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，當(dāng)PPARs激活后能夠與視黃醇類X受體（RXR）形成PPAR-RXR二聚體，與DNA結(jié)合后具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、脂肪形成、炎癥基因的表達(dá)以及維持代謝穩(wěn)態(tài)的作用[36]。PI3K/AKT信號(hào)通路是經(jīng)典的響應(yīng)胰島素信號(hào)的通路，能夠通過RTK-IRS1途徑被胰島素激活，從而促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收和利用。PI3K/AKT信號(hào)通路同時(shí)也參與了增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，活化的AKT通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、核因子κB、GSK-3、FKHR等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。PTEN是PI3K/AKT信號(hào)通路中的主要抑制因子，相關(guān)研究表明，在db/db小鼠的肝臟中存在AKT信號(hào)通路抑制從而導(dǎo)致肝臟糖代謝異常，通過調(diào)節(jié)PTEN能夠重新激活A(yù)KT信號(hào)通路并促進(jìn)肝糖原的合成[37]。

本研究最后對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所分析的結(jié)果進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們以db/db小鼠作為動(dòng)物模型，選擇PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)“人參-黃連-三七”藥串治療IR合并NAFLD的作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。db/db小鼠是一種遺傳性瘦素抵抗小鼠模型，具有瘦素水平較普通小鼠升高但出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少、貪食、極度肥胖、代謝減退和低體溫的特點(diǎn)[38]。db/db小鼠能夠自發(fā)形成IR與脂肪肝，但在普通飼料喂養(yǎng)下db/db小鼠無法自發(fā)地由單純性脂肪肝發(fā)展成脂肪性肝炎[39]，因此適合作為本研究中觀察中藥對(duì)IR合并NAFLD療效與作用機(jī)制的動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)，“人參-黃連-三七”藥串能夠改善小鼠血糖情況和IR水平，減輕肝臟脂肪變性，而這一作用可能是通過調(diào)節(jié)肝臟PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。

綜上可見，“人參-黃連-三七”藥串對(duì)改善IR，減輕肝臟脂肪變性有顯著優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)“人參-黃連-三七”藥串對(duì)治療IR合并NAFLD的部分作用靶點(diǎn)以及具體作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療IR合并NAFLD的多靶點(diǎn)、多途徑以及作用機(jī)制相關(guān)的研究提供了方法學(xué)借鑒，并為相關(guān)臨床研究提供了理論支持和研究思路。

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（2021-11-06收稿 本文編輯：吳珊）