張宇韋，李健春，鐘 霞，湯華軍，陳 波

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

各種病理因素導(dǎo)致的慢性腎臟病(CKD)是人類心血管疾病、早衰及終末期腎病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。我國(guó)成年人CKD發(fā)病率為8%～12%[1]，其具有發(fā)病率高、伴發(fā)心血管病率高、病死率高的特點(diǎn)，給醫(yī)療系統(tǒng)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。腎臟纖維化是各種慢性腎病進(jìn)程中的主要病理變化，抗纖維化治療仍是治療重點(diǎn)和難點(diǎn)，單一方法治療腎組織病理改變不明顯，腎功能恢復(fù)不理想。中醫(yī)認(rèn)為纖維化形成主要由氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)或三者相輔作用而成，治療主要選用活血化瘀、益氣養(yǎng)陰、清熱散結(jié)類中藥，其中活血化瘀類藥物抗腎纖維化作用佳[2]。活血化瘀類中藥燈盞花素是從燈盞細(xì)辛中提取的黃酮類化合物，具有解毒、祛風(fēng)除濕、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、消炎止痛及抗凝、抗血栓形成、改善血液流變性及微循環(huán)、提高機(jī)體耐缺氧能力等作用，主要用于心腦血管疾病[3]、高血壓腎病[4]、糖尿病腎病[5]、肝纖維化[6]等的治療。Jiang等[7]報(bào)道燈盞花素可通過磷酸化PKCβⅡ/Akt/JNK1/2/p38信號(hào)通路改善糖尿病腎病小鼠腎臟纖維化。但燈盞花素單獨(dú)治療CKD纖維化療效有限。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是目前最有應(yīng)用前景的干細(xì)胞之一，和腎臟發(fā)育具有中胚層同源性。文獻(xiàn)報(bào)道MSCs無(wú)論是單獨(dú)應(yīng)用，還是與生長(zhǎng)因子聯(lián)用，均能延緩CKD疾病進(jìn)展，有效改善腎功能[8-9]。MSCs可能是通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)、自分泌或過表達(dá)各種生長(zhǎng)因子或免疫調(diào)節(jié)作用延緩CKD病程進(jìn)展達(dá)到抗纖維化作用[10]。本實(shí)驗(yàn)利用MSCs在體外易獲得擴(kuò)增、低免疫原性、具有細(xì)胞因子分泌能力和免疫調(diào)節(jié)能力等優(yōu)勢(shì)，觀察了MSCs與燈盞花素聯(lián)合抗CKD腎臟纖維化的效果和可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SD大鼠50只，體重250～280 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(川)2019-17。大鼠飼養(yǎng)在恒溫20～22 ℃、濕度50%～60%環(huán)境中，晝夜12 h/12 h交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，操作符合西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求(2020773)。

1.2主要藥物及試劑 燈盞花素購(gòu)自湖南恒生制藥股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20063405)。MSCs無(wú)血清專用培養(yǎng)基(N6010)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。一抗I型膠原A1(ColIA1)(# 72026)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，#19245)、Galectin-3(# 87985)、Snail1 (#3879)、p-Akt(#4060)和Akt(#2920)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9，ab38898)抗體購(gòu)自Abcam。血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Sirius Red染色試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。MSCs流式細(xì)胞表型鑒定抗體包括陽(yáng)性標(biāo)記CD44-PE(ab23396)、CD29-PE/Cy7 (ab95622)和陰性標(biāo)記CD45-FITC (ab33916)均購(gòu)自Abcam公司，CD34-FITC (11-0341-82)購(gòu)自 eBioscience。油紅O(G1262，北京索萊寶科技有限公司),茜素紅(ZY121105，上海澤葉生物科技有限公司)。

1.3骨髓源性MSCs原代培養(yǎng)和鑒定 取10只健康雄性SD大鼠[西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(川)2018-065]，體重120～140 g，無(wú)菌條件取出雙下肢股骨和脛骨，用注射器從骨兩端打孔后用無(wú)菌PBS沖出骨髓，收集骨髓，1 000 r/min離心(離心半徑380 mm)3 min后去上清，用無(wú)血清MSCs專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，來自每只大鼠的骨髓懸液接種2瓶細(xì)胞(5×106/瓶)，72 h后全量換液，體外按照1∶3比例傳代。傳至第3代，細(xì)胞經(jīng)流式表面抗原檢測(cè)，CD29、CD44和CD90呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，CD34和CD45呈陰性表達(dá)；油紅O染色發(fā)現(xiàn)大小不一紅色脂滴，證實(shí)MSCs有明顯成脂能力；茜素紅染色試劑盒檢測(cè)顯示橘紅色鈣沉積礦化結(jié)節(jié)，證實(shí)MSCs有明顯成骨能力。

1.4分組、建模及干預(yù) 將50只健康雄性SD大鼠稱重后隨機(jī)分為正常組、模型組、燈盞花素組、MSCs組、燈盞花素+MSCs組，每組10只。除正常組外，其余組大鼠采用阿霉素5 mg/kg尾靜脈一次注射加腺嘌呤150 mg/kg連續(xù)灌胃15 d方法誘導(dǎo)建立CKD模型。建模結(jié)束后，燈盞花素組給予燈盞花素25 mg/kg連續(xù)灌胃7 d；MSCs組在建模結(jié)束后第3天，尾靜脈注射無(wú)菌生理鹽水MSCs細(xì)胞懸液2×106/kg；燈盞花素+MSCs組給予燈盞花素連續(xù)灌胃7 d，同時(shí)建模結(jié)束后第3天尾靜脈注射無(wú)菌生理鹽水MSCs細(xì)胞懸液2×106/kg。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1腎功能和腎臟指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第3天收集24 h尿液，檢測(cè)24 h尿蛋白；經(jīng)10%水合氯醛麻醉大鼠后取血，檢測(cè)血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平；處死大鼠后取腎臟，計(jì)算腎臟指數(shù)(腎臟重量/鼠重×100%)。

1.5.2腎臟組織病理觀察 取各組大鼠部分腎臟組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋進(jìn)行常規(guī)病理切片，分別采用HE染色、Masson染色和Sirius Red染色進(jìn)行腎組織病理觀察。

1.5.3腎臟組織中ColIA1、MMP-9表達(dá)情況 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)：取制備好的各組大鼠腎臟組織石蠟切片，脫蠟梯度復(fù)水，置檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中微波抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，現(xiàn)配3%過氧化氫孵育10 min，PBS洗3次。滴加 5% BSA封閉30 min后甩干，滴加一抗，4 ℃濕盒孵育過夜。PBS洗滌3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染核后水洗，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，每個(gè)樣本采圖3～5張，計(jì)算ColIA1、MMP-9陽(yáng)性標(biāo)記面積累計(jì)光密度IOD值。

1.5.4腎臟組織中Galectin-3/Akt/Snail通路相關(guān)因子表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè)：取各組大鼠腎臟組織200 mg，液氮研磨后加入300 μL RIPA裂解液置冰上振搖30 min，超聲后離心取上清，采用BCA蛋白定量后，加入5×Loading buffer，95 ℃煮沸10 min，小份分裝置-20 ℃冰箱凍存。上樣量40 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉或5%BSA(磷酸化蛋白)封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，每次5 min。加對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用高敏ECL顯色試劑孵育1～2 min后凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)成像。用Gel-Pro Analyzer軟件測(cè)量灰度值，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎功能和腎臟指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組24 h尿蛋白、血清Cr和BUN水平及腎臟指數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)；燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組各指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)，各干預(yù)組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟指數(shù)和腎功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠腎臟組織病理表現(xiàn) HE、Masson和Sirius Red染色顯示，模型組腎組織結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，腎小管腔內(nèi)腺嘌呤結(jié)晶沉著，腎小管管腔擴(kuò)張或萎縮，腎間質(zhì)膠原纖維化明顯增加，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、系膜增厚。燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組腎組織病理改變明顯較模型組輕，其中燈盞花素+MSCs組最輕。見圖2。

圖2 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織HE、 Masson和Sirius Red染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠腎臟組織中ColIA1、MMP-9表達(dá)情況 免疫組化染色顯示，ColIA1主要表達(dá)于腎小管間質(zhì)中，模型組ColIA1陽(yáng)性標(biāo)記面積累計(jì)光密度IOD值明顯高于正常組(P<0.05)，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組(P均<0.05)，MSCs組和燈盞花素+MSCs組陽(yáng)性標(biāo)記更少；MMP-9主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，模型組MMP-9陽(yáng)性標(biāo)記面積累計(jì)光密度IOD值明顯低于正常組(P<0.05)，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯高于模型組(P均<0.05)，MSCs組和燈盞花素+MSCs組陽(yáng)性標(biāo)記更明顯。見圖3及圖4。

圖3 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織中ColIA1和MMP-9免疫組化染色表現(xiàn)

圖4 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織中ColIA1和MMP-9陽(yáng)性標(biāo)記面積累計(jì)光密度IOD值比較

2.4各組大鼠腎臟組織中Galectin-3/Akt/Snail通路相關(guān)因子表達(dá)情況 模型組腎臟組織中p-Akt/Akt、α-SMA、Galectin-3、Snail1表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組(P均<0.05)，燈盞花素+MSCs組p-Akt/Akt、Snail1表達(dá)量明顯低于燈盞花素組和MSCs組(P均<0.05)，燈盞花素組和燈盞花素+MSCs組Galectin-3表達(dá)量明顯低于MSCs組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 正常組和慢性腎臟病各組大鼠腎臟組織中p-Akt、α-SMA、Snail1和Galectin-3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

燈盞花素主要用于心腦血管疾病的治療，尤其在高血壓誘導(dǎo)性腎病中和抗高血壓類藥物聯(lián)用能明顯降低24 h尿蛋白，顯著改善腎功能[4]，但也有文獻(xiàn)報(bào)道燈盞花素在高劑量時(shí)不僅不能起到降壓作用反而有升壓作用[11]。Mei等[12]報(bào)道，在經(jīng)典的單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中，燈盞花素可通過抑制腎臟對(duì)水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的下調(diào)起到腎臟保護(hù)作用。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素可以通過抑制巨噬細(xì)胞募集、減輕氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)血脂異常而降低尿蛋白，改善腎功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，燈盞花素組24 h 尿蛋白、血清Cr和BUN水平、腎臟指數(shù)及腎臟組織中ColIA1陽(yáng)性標(biāo)記面積累計(jì)光密度IOD值、α-SMA表達(dá)量均明顯低于模型組，MMP-9陽(yáng)性標(biāo)記面積累計(jì)光密度IOD值明顯高于模型組。提示燈盞花素單獨(dú)應(yīng)用可改善腎功能，能減少腎臟組織膠原成分ColIA1和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)，可增加具有降解腎小管間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)作用的MMP-9表達(dá)，證明其有一定程度的抗纖維化作用。

Galectin-3是一種IgE、層黏連結(jié)合蛋白，對(duì)β-半乳糖苷有高親和力，通過碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域的N-連接或O-連接的糖基化作用與β-半乳糖苷糖結(jié)合[14]。Galectin-3在胞外涉及細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏附，細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞凋亡和血管生成等功能；在細(xì)胞核中作為前mRNA剪接因子，參與急性炎癥反應(yīng)，包括中性粒細(xì)胞活化和黏附、單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞的化學(xué)吸引、凋亡中性粒細(xì)胞的調(diào)理素作用、肥大細(xì)胞的活化[15]?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)Galectin-3獨(dú)特表達(dá)于心、腎、血管等器官以及巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞[16]，其由腎、肝和心臟纖維化中活化的肌成纖維細(xì)胞分泌，且其血清水平的上升早于CKD的發(fā)生，已被提出作為評(píng)價(jià)腎臟纖維化進(jìn)程以及心、肝纖維化進(jìn)程新的生物學(xué)標(biāo)志物[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組腎臟組織中Galectin-3表達(dá)量明顯高于正常組，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組，燈盞花素組和燈盞花素+MSCs組Galectin-3表達(dá)量有明顯低于MSCs組的趨勢(shì)。提示燈盞花素抑制CKD后腎臟組織Galectin-3表達(dá)可能是其發(fā)揮抗纖維化作用的重要原因，MSCs單獨(dú)應(yīng)用雖也能減少Galectin-3表達(dá)，但抑制作用不如單用燈盞花素，這可能和MSCs自身能分泌Galectin-3有關(guān)[18]。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)和Galectin-3功能推測(cè)，Galectin-3的促纖維化機(jī)制可能與整合素家族某些成員發(fā)生作用，一方面影響了Integrin/ILK的表達(dá)，進(jìn)一步激活A(yù)kt或者GSK-3β磷酸化，使下游促纖轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist等下調(diào)，激活EMT[19-20]；另一方面Integrin家族成員可能和TIMP家族成員發(fā)生作用，影響了MMPs家族成員活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)生成和降解失衡，ECM表達(dá)增加，促進(jìn)了纖維化進(jìn)程。因此檢測(cè)上述重點(diǎn)指標(biāo)，結(jié)果顯示模型組腎臟組織中p-Akt/Akt、Snail1表達(dá)量均明顯高于正常組，燈盞花素組、MSCs組和燈盞花素+MSCs組均明顯低于模型組，燈盞花素+MSCs組p-Akt/Akt、Snail1表達(dá)量明顯低于燈盞花素組和MSCs組。提示燈盞花素可抑制腎臟組織Akt磷酸化，下調(diào)Snial1表達(dá)，部分說明燈盞花素可能通過Galectin-3/Akt/Snail信號(hào)通路發(fā)揮抗纖維化作用。同時(shí)MSCs可以抑制Akt磷酸化及Snial1表達(dá)而產(chǎn)生抗纖維化效果，在和燈盞花素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制效果更明顯。

綜上所述，活血化瘀類中藥燈盞花素和MSCs可能通過調(diào)控Galectin-3/Akt/Snail通路協(xié)同發(fā)揮更好的抗CKD腎臟纖維化作用，為臨床治療各類慢性腎病纖維化提供了新的思路，但二者抗纖維化機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。