于 潼，謝利民，張振南，李玉彬，白 楊

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

隨著糖皮質(zhì)激素的大量應(yīng)用，激素性股骨頭壞死的發(fā)生率逐年增加[1]。糖皮質(zhì)激素可能通過多種途徑促進成骨細胞凋亡、增加破骨細胞活性及促進骨髓間充質(zhì)干細胞脂肪化從而引發(fā)股骨頭壞死，但目前關(guān)于激素性股骨頭壞死的機制尚無確切定論。近年來關(guān)于激素性股骨頭壞死機制性研究多是圍繞骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)開展的[2]，研究發(fā)現(xiàn)激素可誘導(dǎo)BMSCs成骨能力減弱、成脂肪分化能力增強[3-4]，即抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化而轉(zhuǎn)向促脂肪細胞分化。但激素影響B(tài)MSCs活性的途徑尚不清楚。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)以健脾利濕、補腎生髓、活血通絡(luò)為法結(jié)合臨床組方的健脾補腎方可有效緩解股骨頭壞死患者臨床癥狀，改善髖關(guān)節(jié)功能[5-6]；動物實驗證實該方可誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，促進膠原纖維鈣鹽沉積，從而修復(fù)骨組織而扭轉(zhuǎn)骨壞死[7]。而干細胞分化方向與細胞因子的調(diào)控作用密切相關(guān)[8-11]，據(jù)此推測健脾補腎方可能通過調(diào)控細胞因子而誘導(dǎo)促進激素性股骨頭壞死BMSCs定向成骨分化。故本研究擬選擇與成骨細胞分化相關(guān)的細胞因子，觀察健脾補腎方對上述細胞因子的影響，從而篩選與健脾補腎方調(diào)控股骨頭壞死BMSCs定向成骨細胞分化的相關(guān)細胞因子，并為深入探索健脾補腎方治療激素性股骨頭壞死的機制研究提供前期基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠12只，體重約200 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，合格證編號：SCXK( 京 )2019-0010。每籠2只，標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水?dāng)z食喂養(yǎng)，室溫控制在21～24 ℃，濕度維持在40%～70%，光照晝夜交替12 h。

1.2藥品與試劑 健脾補腎方由茯苓、杜仲、菟絲子、炒白術(shù)、炙甘草、川牛膝、醋延胡索、紅花等藥物組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院免煎藥房提供。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉, 瑞士輝瑞公司，批號:X60837；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，批號:D0709203；大腸桿菌內(nèi)毒素L2880，美國Sigma公司，批號：039M4004V。

1.3主要儀器與設(shè)備 精密移液器(Eppendorf)，低溫冷凍離心機(Heal Force，Neofuge 13R)，酶標(biāo)儀(Biotek，Synergy H4)，搖床(蘇坤，SKY-200B)，漩渦儀(天力，TL96-A),Fresco低溫冷凍離心機(Thermo),MultiSkan3酶標(biāo)儀(Thermo),Mini P-4電泳槽(Cavoy),濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy),電泳儀(Bio-Rad)。

1.4實驗方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為空白組、模型組、健脾補腎方組, 每組4只 。模型組及健脾補腎方組參考文獻[12-13]建立激素性股骨頭壞死模型：大腸桿菌內(nèi)毒素20 μg/kg 腹腔注射2次，每次間隔24 h；末次注射內(nèi)毒素24 h后，給予甲潑尼龍琥珀酸鈉40 mg/kg 臀肌注射3次，每次間隔24 h，注射激素后給予腹腔注射青霉素鈉4×104IU預(yù)防感染，1次/d?？瞻捉M僅注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后，健脾補腎方組每天灌胃2 g/mL健脾補腎湯[根據(jù)人與動物體表面積換算公式D鼠=D人×R鼠/R人(D為給藥劑量，R為動物與人體表面積比值系數(shù))及前期實驗經(jīng)驗計算給藥量[7，14]],灌胃量為10 mL/kg，模型組和空白組每天灌胃等量生理鹽水，3組均連續(xù)灌胃12周。實驗過程中觀察各組大鼠運動、飲食等一般情況。

1.5樣本采集 灌胃12周后，使用10 mL注射器抽取腹主動脈血液，4 ℃ 3 500 r/min離心(離心半徑8.5 cm)15 min，分離出血清備用。處死各組大鼠，取股骨頭，用骨鉗將股骨頭內(nèi)組織夾碎，將夾碎的組織置于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，加入9倍無菌生理鹽水轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 ℃ 3 000 r/min離心(離心半徑8.5 cm)15 min，吸取上清液加入到新的1.5 mL EP管中備用。

1.6檢測指標(biāo)及方法 應(yīng)用雙抗體一步夾心法試劑盒酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和Western blot法分別檢測各組大鼠血清及股骨頭組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍性生長因子(PDGF)、成骨特異性細胞轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)表達情況。 ELISA檢測按照說明書操作。Western blot檢測：根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%，將檢測蛋白樣品上樣，20 μg/孔，電泳條件：濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，通過marker來確定電泳停止時間。轉(zhuǎn)膜：300 mA恒流，0.45 μm孔徑NC膜，轉(zhuǎn)膜1 h，染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果，封閉。一抗孵育：用3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，4 ℃過夜，第2天取出膜，室溫孵育30 min。洗膜：TBST洗膜5次，每次3 min。二抗孵育：用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L) HRP 或山羊抗小鼠IgG(H+L) HRP，1∶10 000，室溫輕搖 40 min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光10 s～5 min(曝光時間隨不同光強度而調(diào)整)，顯影2 min，定影。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 在灌胃干預(yù)的前2周，模型組與健脾補腎方組大鼠少動,步態(tài)輕微跛行，進食減少，精神萎靡，毛發(fā)干枯；2周后，健脾補腎方組大鼠活動增多，進食恢復(fù)，精神逐步好轉(zhuǎn)，毛發(fā)逐漸恢復(fù)正常光澤?？瞻捉M動物正常飲食飲水。

2.2各組大鼠ELISA檢測血清及骨組織中相關(guān)細胞因子水平 健脾補腎方組血清BMP-2、TGF-β、VEGF水平及骨組織中BMP-2水平均明顯高于空白組和模型組(P均<0.05)，空白組均明顯高于模型組(P均<0.05)；其余指標(biāo)各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1及表2。

表1 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠ELISA檢測血清相關(guān)細胞因子水平比較

表2 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠ELISA檢測骨組織中相關(guān)細胞因子水平比較

2.3各組大鼠Western blot檢測血清及骨組織中相關(guān)細胞因子表達情況 條帶圖顯示，健脾補腎方組血清BMP-2表達量高于空白組和模型組，血清TGF-β表達量高于模型組，其余指標(biāo)未見明顯不同。見圖1及圖2。

圖1 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠Western blot檢測血清相關(guān)細胞因子表達情況

圖2 空白組和激素性股骨頭壞死各組大鼠Western blot檢測骨組織中相關(guān)細胞因子表達情況

3 討 論

《脾胃論·脾胃勝衰論》云：“脾病則下流乘腎，土克水則骨乏無力，是為骨蝕，令人骨髓空虛，足不能履地?！逼㈥柌蛔銊t運化傳輸不利，水津敷布失常，聚而生痰化濕；水濕之邪下聚于腎，則致腎之開闔不利，溫煦失職，血失去溫煦，遇寒則凝，聚而成瘀，形成痰瘀阻絡(luò)的病理產(chǎn)物。健脾補腎方中茯苓甘平，善入脾經(jīng)，益脾和胃、利水滲濕化痰；白術(shù)甘溫，歸脾胃經(jīng)，健脾益胃、和中燥濕利水，現(xiàn)代藥理研究證實白術(shù)具有增強免疫、促進骨生長、抗血小板聚集等功能[15-16]，其與茯苓合用可健脾益氣、化痰滲濕，脾胃健運則痰濕得以化無以生，氣血生化有源，精髓充滿。杜仲甘溫，歸肝腎經(jīng)，補肝腎、強筋骨；菟絲子平微辛，歸肝脾腎經(jīng)，補腎益精、善補腎陽，為平補陰陽之品，與杜仲合用可以溫補腎陽、益精填髓、強筋健骨。胡曉梅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，局部運用菟絲子總多糖可能通過促進Ⅱ型膠原的表達而修復(fù)家兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。杜仲及其提取物可促進成骨細胞的增殖與分化成熟以促進骨形成和愈合，同時還可間接抑制破骨細胞的分化和成熟，從而抑制骨吸收，以提高骨質(zhì)量和骨強度[18-21]。牛膝甘苦酸平，入肝腎經(jīng)，功善散瘀血、補肝腎、強筋骨，既入血分，又入氣分，引藥下行；延胡索辛苦溫，功善活血、散瘀、理氣、止痛；紅花辛溫，為活血通經(jīng)、祛瘀止痛之要藥；三藥共用以活血祛瘀、行氣止痛，氣為血帥，血為氣母，氣行則推動血行，血行則不聚不瘀。甘草甘平，和中緩急，調(diào)和諸藥。方聚補虛化痰祛瘀為一體，諸藥兼施，攻守有度，共奏健脾利濕、補腎生髓、活血通絡(luò)之功。健脾化痰濕，斷痰濕生化傳變之路，痰濕不聚則瘀滯不生；補腎生髓則腎充精足，骨骼筋骨得以濡養(yǎng)；同時輔以通絡(luò)祛瘀之品，瘀祛新生而開氣血周轉(zhuǎn)運行之道，則氣血生化有源，精髓得以充養(yǎng)，骨骼筋脈健運有力。骨髓間充質(zhì)干細胞來源于中胚層的未分化間充質(zhì)干細胞[22-23]，具有多向分化潛能，可分化成脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等多種細胞，而各種細胞因子和生長因子對其分化方向有著重要影響[8-11，24]。前期觀察健脾補腎方對家兔激素性股骨頭壞死模型的影響發(fā)現(xiàn)，健脾補腎方可有效促進骨組織修復(fù)，遏制骨髓間質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化的趨勢而轉(zhuǎn)向向成骨細胞分化，且成骨細胞分泌的膠原纖維上鈣鹽逐漸沉積、形成明顯的鈣結(jié)節(jié)，從而促進骨組織修復(fù)[7]。本實驗結(jié)果顯示，ELISA法檢測健脾補腎方組血清BMP-2、TGF-β、VEGF水平及骨組織中BMP-2水平均明顯高于模型組，Western blot法檢測健脾補腎方組血清BMP-2、TGF-β表達量高于模型組。據(jù)此推測健脾補腎方可能通過對BMP-2和TGF-β因子的調(diào)控而促進骨髓間充質(zhì)干細胞定向成骨分化而促進骨壞死修復(fù)。

綜上所述，健脾補腎方可能通過調(diào)控BMP-2、TGF-β表達而促進骨髓間充質(zhì)干細胞定向成骨分化，從而扭轉(zhuǎn)骨壞死。但本研究為前期預(yù)實驗，主要目的在于篩選可能與健脾補腎方調(diào)控股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化成骨細胞相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，為后期深入探討健脾補腎方防治股骨頭壞死的機制研究提供前期理論基礎(chǔ)，其確切機制還需擴大樣本量進一步深入研究驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。