唐 眾，凌 潔，黃維芳

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC )公布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過了肺癌的220萬例，乳腺癌取代肺癌成為全球第一大癌，同時(shí)每年超過68萬人死于乳腺癌[2-3]。目前針對(duì)乳腺癌的治療手段眾多，但多數(shù)治療手段具有不同程度的毒副作用，難以滿足乳腺癌患者的需求[4]。諸多研究表明，中醫(yī)藥治療乳腺癌存在多通路、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，能夠有效改善臨床癥狀，延緩遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，延長生存期限，提高生活質(zhì)量[5-6]。消癰乳康方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺科臨床運(yùn)用多年證實(shí)有效的治療乳腺疾病的驗(yàn)方，該方用于治療乳腺癌有較好的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)從Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(JAK2/STAT3)通路角度觀察了消癰乳康方對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞惡性腫瘤生物學(xué)行為的影響，以進(jìn)一步探究消癰乳康方的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療乳腺癌提供新思路與新方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院細(xì)胞庫目錄號(hào)：TCHu 74)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 胎牛血清、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、雙抗、0.25%胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司(生產(chǎn)批號(hào)：1640958，AD24221175，SV345103，SH30042)；培養(yǎng)瓶、離心管、巴氏管等一般消耗品購于美國NEST公司；細(xì)胞侵襲小室、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購于美國Thermo公司(生產(chǎn)批號(hào)：TH269087，THB334077)；兔抗JAK2、兔抗磷酸化JAK2(p-JAK2)、兔抗STAT3、兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體均購于美國Proteintech公司；SYBR Green PCR檢測工具購于美國SantaCruz公司(FAST480Ⅱ型)。實(shí)驗(yàn)儀器均為中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，倒置生物顯微鏡購于日本Olympus公司(OY34004型)；流式細(xì)胞儀購于美國BD公司，其余儀器均由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物制備 消癰乳康方組方：郁金15 g、肉蓯蓉15 g、女貞子15 g、乳香10 g、沒藥10 g，中藥飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林門診部藥房并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院全國名中醫(yī)劉紹貴教授進(jìn)行鑒定。將中藥飲片研磨成粉末，按一定比例煎煮濃縮后制成膏狀物，并按人臨床等效濃度配制成含原藥材2.88 g/mL。在使用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的濃度以分析天平稱取消癰乳康方浸膏并置于PBS中，借助超聲震蕩儀進(jìn)行震蕩處理30 min使其充分溶解，吸取其上清液并借助0.22 μm的濾膜完成雜質(zhì)濾過，以棕色瓶避光儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。在使用時(shí)以1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與分組 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為5% CO2、溫度37 ℃。將細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組以1640培養(yǎng)基進(jìn)行干預(yù)，消癰乳康方高濃度組、消癰乳康方中濃度組、消癰乳康方低濃度組以16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的消癰乳康方進(jìn)行干預(yù)。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況 在培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，離心后將其密度調(diào)整至1×107/mL。將細(xì)胞懸液200 μL種植至96孔板，并設(shè)置6個(gè)復(fù)孔進(jìn)行觀察，靜置24 h以倒置顯微鏡觀察到MCF-7細(xì)胞完全貼壁后，消癰乳康方各濃度組加入相應(yīng)濃度的消癰乳康方藥液分別干預(yù)24 h、48 h、72 h，運(yùn)用CCK8法檢測細(xì)胞在490 nm波長處的光密度(OD)值。細(xì)胞抑制率=(1-OD值藥物組/OD值對(duì)照組)×100%。

1.5.2流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡情況 在培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，接種至無菌6孔板中。各組加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，干預(yù)24 h后離心收集細(xì)胞，置于0.1 mL的binding buffer中，將其密度調(diào)整至1×105/mL，PBS清洗后加入AnnxinV及PI染液(終質(zhì)量濃度均為5 μg/mL)，孵育15 min后再次加入binding buffer，過濾后置于流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.5.3Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 按照標(biāo)準(zhǔn)Transwell法檢測MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，提前預(yù)冷試劑及操作器械，在4 ℃環(huán)境下將Matrigel基質(zhì)膠均勻平鋪于Transwell小室并靜置30 min；空白培養(yǎng)基洗滌Transwell上室備用。在培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，離心后將其密度調(diào)整至5×105/mL；移液槍將細(xì)胞液懸液200 μL吸取至Transwell上室中，空白對(duì)照組添加1640培養(yǎng)基、消癰乳康方各濃度組添加相應(yīng)濃度的消癰乳康方藥液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；之后添加200 μL含15%的完全培養(yǎng)基至下室，置于5% CO2、溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，多聚甲醛固定10 min后以DAPI進(jìn)行避光染色，之后隨機(jī)選取6個(gè)視野觀察拍照并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.5.4RT-PCR法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達(dá) 收集各組采用相應(yīng)方法培養(yǎng)48 h后的MCF-7細(xì)胞，提取其總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性與純度,要求能夠清晰呈現(xiàn)28s、18s條帶,OD260 / OD280 比值介于1.8～2.0之間。取總RNA 20～50 μg,去除RNA基因組,按照試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參基因并擴(kuò)增。參照說明書設(shè)定PCR程序,95 ℃ 10 min變性,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,重復(fù)40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束,設(shè)定最佳閾值,獲取Ct(threshold cycle)值，以相對(duì)定量2-ΔΔCt分析上述基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.5Western blot法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 收集各組采用相應(yīng)方法培養(yǎng)48 h后的MCF-7細(xì)胞，提取相關(guān)蛋白，經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)印、洗膜、封閉等操作后添加JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體(1∶2 000)，4 ℃環(huán)境靜置過夜。洗膜后添加對(duì)應(yīng)二抗(1∶5 000)，室溫環(huán)境下靜置30 min后進(jìn)行顯色操作，將β-actin作為內(nèi)參蛋白，并在Quantity One軟件上進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組MCF-7細(xì)胞抑制率比較 消癰乳康方低、中、高濃度組處理MCF-7細(xì)胞24 h、48 h、72 h后細(xì)胞抑制率均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組細(xì)胞抑制率逐漸增高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制率比較

2.2各組MCF-7細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下，空白對(duì)照組培養(yǎng)24 h后MCF-7細(xì)胞貼壁，生長良好，呈長梭形或多邊形，細(xì)胞個(gè)體飽滿，胞質(zhì)豐富，輪廓清晰，呈簇狀聚集；消癰乳康方各濃度組均可見貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，呈散在排列，部分細(xì)胞體積改變，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，裂解成碎片，其中消癰乳康方高濃度組最為顯著。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下各組培養(yǎng)24 h后乳腺癌MCF-7細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.3各組 MCF-7細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組和消癰乳康方低、中、高濃度組的MCF-7細(xì)胞總凋亡率(Q2+Q4)分別為(6.63±2.14)%、(20.06±3.25)%、(31.52±3.64)%、(38.21±4.02)%，消癰乳康方各濃度組均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組逐漸增高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。流式細(xì)胞圖見圖2。

圖2 各組培養(yǎng)24 h后乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡情況

2.4各組MCF-7細(xì)胞侵襲能力比較 培養(yǎng)24 h后，消癰乳康方低、中、高濃度組和空白對(duì)照組MCF-7細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(86.46±4.65)個(gè)、(62.25±4.02)個(gè)、(36.57±3.45)個(gè)、(146.57±5.24)個(gè)，消癰乳康方各濃度組細(xì)胞穿膜數(shù)均明顯少于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組細(xì)胞穿膜數(shù)逐漸減少，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組培養(yǎng)24 h后乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲情況(×400)

2.5各組MCF-7細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表達(dá)情況比較 培養(yǎng)48 h后，消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 各組乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.6各組MCF-7細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況比較 培養(yǎng)48 h后，消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組(P均<0.05)，且消癰乳康方低、中、高濃度組JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖4及表3。

表3 各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖4 各組乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

目前全球范圍內(nèi)乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)升高并呈年輕化態(tài)勢，極大程度上威脅了女性的生命與健康。

Sharma等[7]針對(duì)3 566名乳腺癌患者進(jìn)行大數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果顯示，乳腺癌較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移侵襲的生物學(xué)特性是造成患者死亡的重要原因。目前早期乳腺癌主要采取手術(shù)治療，術(shù)后根據(jù)患者情況給予放化療、靶向治療等多途徑、多策略干預(yù)[8-9]，但多數(shù)治療手段存在程度不一的毒副反應(yīng)，因此尋求高效、低毒副作用的治療方法勢在必行。中醫(yī)認(rèn)為乳腺癌屬于“乳巖”“石乳”“石奶”等疾病范疇，其發(fā)病多為外邪侵襲、七情內(nèi)傷導(dǎo)致沖任失調(diào)、氣滯血瘀、陽虛寒凝，日久遷延，則虛、寒、瘀、痰等病因及病理產(chǎn)物于乳房局部停滯形成乳腺癌[10-11]。消癰乳康方具有調(diào)攝沖任、活血化瘀、溫經(jīng)散寒等功效，切合上述病機(jī)，但其作用機(jī)制尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了相關(guān)探討。

乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，大多數(shù)研究認(rèn)為其發(fā)生可能與女性基因缺陷、自身免疫因素、內(nèi)分泌紊亂、生活作息、飲食或環(huán)境等因素相關(guān)[2]。近年來研究顯示，JAK2/STAT3信號(hào)通路可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著極為重要的角色[12]。Ding等[13]研究顯示，JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路能夠介由對(duì)下游各類影響因子及效應(yīng)分子進(jìn)行活化，進(jìn)而對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，是乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性的重要信號(hào)通路之一。STAT3基因被認(rèn)為是多種惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點(diǎn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路是STAT3基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵信號(hào)通路。Zhang等[14]研究表明，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，往往伴隨著JAK基因與STAT基因的非正常表達(dá)及異?；钴S，特別是在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移階段，JAK2/STAT3信號(hào)通路多處于穩(wěn)定的活化狀態(tài)。JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵基因JAK2、STAT3能夠調(diào)控G1/S-特異性周期蛋白-D1(cyclinD1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)以及促凋亡基因Bax等腫瘤細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)控蛋白的表達(dá)，參與惡性腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等多個(gè)惡性生物學(xué)進(jìn)程，與乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲息息相關(guān)[15]。Nafie等[16]研究表明，乳腺癌細(xì)胞的增殖過程中JAK2/STAT3信號(hào)通路可明顯上調(diào)Bcl-2以及cyclinD1的蛋白表達(dá)，通過藥物抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路能夠有效促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。Zhang等[17]研究顯示，JAK2/STAT3信號(hào)通路的異常活化密切參與了乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤小血管生成等。Noori等[18]認(rèn)為JAK2/STAT3信號(hào)通路是乳腺癌新藥開發(fā)的最熱門靶點(diǎn)信號(hào)通路之一。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消癰乳康方各濃度組MCF-7細(xì)胞抑制率和凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組，細(xì)胞穿膜數(shù)均明顯少于空白對(duì)照組，JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組，并表現(xiàn)出濃度依賴性。提示消癰乳康方可有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與其抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。