方艷惠 康曉麗 朱巧英 劉婷 劉勝冬

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科（石家莊050011）

宮頸癌（cervical cancer，CC）是全球四大女性惡性腫瘤之一，每年新增病例數(shù)逾50 萬［1?2］。隨著宮頸癌早期篩查技術(shù)的發(fā)展［3］以及HPV 疫苗的臨床應(yīng)用，發(fā)病率有所降低［4?5］。但其預(yù)后較差主要是由于局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，因此研究宮頸癌分子機制對改善其預(yù)后不良有重要意義［6］。

研究表明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中miR?21、miR?34［7］、miR?187［8］、miR?221［9］等多種miRNAs 已證實與宮頸癌機制有關(guān)，本團隊曾發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，miR?496 通過調(diào)控SFMBT1 抑制子宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［10］，但miRNA與靶基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與癌癥的發(fā)展，本研究將進一步探究miR?496 以及其潛在靶點在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制研究。前期通過生信軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，重組人缺陷于清選蛋白neddylation蛋白1 域含1（DCUN1D1）是miR?496 潛在靶基因，DCUN1D1 作為一種致癌基因，已證實在包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥中異常高表達，并與腫瘤的惡性進展和不良預(yù)后有關(guān)［11-12］。因此本研究旨在觀察miR?496 與DCUN1D1 在宮頸癌中的作用及工作機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑宮頸癌腫瘤標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本來自本院78 例接受手術(shù)的宮頸癌患者，所涉及標(biāo)本患者均簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。Hela 細(xì)胞購買自購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640 培養(yǎng)基購買自Gibco 公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購自美國Thermo 公司，Transwell 小室、Matrigel 膠購自美國Corning 公司，抗體購買自Abcam 公司，miR?496 mimics 和陰性對照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 免疫熒光實驗檢測蛋白表達將組織切片脫蠟入水，微波加熱法修復(fù)抗原，（94 ℃，10～15 min），加入5%的正常羊血清封閉，37 ℃，60 min。滴加1∶500 比例稀釋的DCUN1D1 抗體，4 ℃過夜。滴加熒光素標(biāo)記的二抗，37 ℃，60 min。棄二抗，4 ℃避光，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HeLa 細(xì)胞株使用含10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 作為細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃含95%空氣和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HeLa 細(xì)胞株分為對照組，miR?496 組和miR?496+DCUN1D1組，待細(xì)胞生長融合度至70%～90%時，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 說明書對細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染。

1.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灷胢icroRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR?496 與DCUN1D1 可能的作用位點。構(gòu)建DCUN1D1 野生型3′?UTR 熒光素梅質(zhì)粒pMIR?WT 和突變型質(zhì)粒pMIR?Mut。將pMIR?WT、pMIR?Mut 與PTEN mimics 和negative control miRNA mimics 共轉(zhuǎn)染進HeLa 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后，每孔加入100 μL 被動裂解液，使用酶標(biāo)儀配套軟件進行結(jié)果分析。

1.5 qRT?PCR 檢測mRNA 表達按照Trizol 試劑盒步驟提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA進行RNA 逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照qRT?PCR 試劑盒說明書進行PCR 反應(yīng)，qRT?PCR 結(jié)果以CT 值形式表示。

1.6 Western blot檢測蛋白表達采用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞或組織蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，取上樣緩沖液與樣品混合并置于95℃變性10 min。電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。將使用抗體稀釋液以1∶500 比例稀釋的DCUN1D1抗體和1∶1 000 稀釋的GAPDH 抗體加入至PVDF膜，GAPDH 為內(nèi)參。4 ℃過夜。加入1∶1 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。等體積混合ECL 發(fā)光液A、B 液，滴加至PVDF 膜，放入成像系統(tǒng)曝光。

1.7 CCK8 實驗檢測宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖能力各組HeLa 細(xì)胞以2 000 個/孔的量接種細(xì)胞到96 孔板，每孔200 μL 細(xì)胞懸液。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72 h后，按照CCK?8試劑盒操作說明書于每孔加入10 μL CCK?8 溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，在450 nm波長下測定吸光度。

1.8 Transwell 實驗檢測宮頸癌HeLa 細(xì)胞遷移、侵襲能力遷移實驗：各組HeLa 細(xì)胞細(xì)胞密度為1 × 106個/mL，然后將200 μL 的細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室中，在24 孔板內(nèi)與小室的間隙中加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)18～24 h。取出Transwell 小室，用PBS 緩沖液擦掉濾膜上層細(xì)胞，固定10 min，放入0.5%結(jié)晶紫染色液中（10 min），在顯微鏡下觀察濾膜下層細(xì)胞。侵襲實驗：將-20 ℃保存的Matrigel 置4 ℃冰箱18～24 h，次日將50 μL 稀釋好的Matrigel（1∶9）均勻鋪于Transwell 底部（37 ℃，3 h），其余步驟與Transwell遷移實驗相同。

1.9 構(gòu)建宮頸癌裸鼠移植瘤模型選取BALB/c裸鼠12 只，6～ 8 周，體質(zhì)量19～ 23 g，所有裸鼠隨機分為對照組（6 只）和miR?496 組（6 只）。HeLa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用1 mL 注射器將細(xì)胞懸液注射到裸鼠的右后肢腋部皮下，每只裸鼠接種細(xì)胞數(shù)為1 ×107個/只。隨后將裸鼠置于SPF 級動物實驗室飼養(yǎng)。21 d 處死裸鼠，腫瘤組織稱重、固定。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS Statistics 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中DCUN1D1和miR?496的表達免疫熒光和Western blot 檢測結(jié)果顯示DCUN1D1蛋白在宮頸癌組織表達明顯高于癌旁正常組織（P< 0.01，圖1A、C）。qRT?PCR 結(jié)果顯示宮頸癌組織中DCUN1D1 的mRNA 表達明顯升高，而miR?496 表達顯著降低（P<0.01，圖1B、D）。

圖1 宮頸癌組織中DCUN1D1 的表達Fig.1 Expression of DCUN1D1 in cervical cancer tissue

2.2 不同分期宮頸癌組織中miR?496、DCUN1D1的mRNA 表達水平qRT?PCR 結(jié)果顯示，宮頸癌的臨床分期越高，DCUN1D1 的mRNA 表達水平越高，miR?496 表達水平越低（P<0.01，圖2）。

圖2 不同分期宮頸癌組織中miR?496、DCUN1D1 的mRNA 表達Fig.2 Expression of miR?496 and DCUN1D1 in cervical cancer tissue of different stages

2.3 DCUN1D1 是miR?496 靶基因采用Target Scan 篩選miR?496 的潛在靶基因發(fā)現(xiàn)DCUN1D1 的3′?UTR上具有潛在的結(jié)合位點與miR?496形成互補結(jié)合（圖3A）。雙熒光素酶報告基因試驗顯示轉(zhuǎn)染pMIR?DCUN1D1?wt 質(zhì)粒miR?496 組熒光素酶活性明顯降低，轉(zhuǎn)染pMIR?DCUN1D1?Mut 質(zhì)粒miR?496組熒光素酶活性無明顯影響（P<0.01，圖3B）。miR?496 mimics 轉(zhuǎn)染進HeLa 細(xì)胞后，細(xì)胞中miR?496的表達水平較對照組明顯升高（P< 0.01，圖4A），qRT?PCR 和Western blot 結(jié)果顯示，相比對照組，miR?496 組的細(xì)胞中DCUN1D1 的mRNA 和蛋白表達均明顯降低（P<0.01，圖4B、C）。

圖3 預(yù)測并驗證DCUN1D1 是miR?496 靶基因Fig.3 DCUN1D1 is the target gene of miR?496

圖4 miR?496 負(fù)調(diào)控DCUN1D1 表達Fig.4 miR?496 negatively regulates the expression of DCUN1D1

2.4 miR?496 和DCUN1D1 對HeLa 細(xì)胞生物功能的調(diào)控CCK8 法結(jié)果示，相比對照組，miR?496 mimics 組中OD值明顯降低，但miR?496+DCUN1D1組的OD值明顯高于miR?496 mimics 組（P< 0.01，圖5A）。Transwell 實驗結(jié)果顯示，相比對照組，miR?496 組遷移和侵襲細(xì)胞計數(shù)均明顯降低，但相比miR?496 組，miR?496+DCUN1D1 組細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強（P<0.01，圖5B）。

圖5 miR?496 和DCUN1D1 對宮頸癌HeLa 細(xì)胞生物功能的調(diào)控Fig.5 Regulation of miR?496 and DCUN1D1 on the biological function of cervical cancer HeLa cells

2.5 宮頸癌裸鼠移植瘤模型以及DCUN1D1 表達21 d 后宮頸癌移植瘤模型結(jié)果示，miR?496 組裸鼠中移植瘤體積和重量明顯低于對照組（P<0.01，圖6A、B）。免疫熒光結(jié)果顯示，miR?496 組裸鼠中DCUN1D1 和Ki67 陽性信號均明顯低于對照組（P<0.01，圖6C）。

圖6 miR?496 在宮頸癌裸鼠移植瘤模型表達Fig.6 Expression of miR?496 in xenograft model of cervical cancer in nude mice

3 討論

在各種癌癥的發(fā)生發(fā)展中，miRNA作為致癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮著重要作用［13-15］。研究顯示，miR?496 與多種癌癥發(fā)病機制相關(guān)，ALQURASHI等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR?496 在內(nèi)的5 種miRNAs 在結(jié)直腸癌中表達下調(diào)。MA 等［17］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，miR?496 通過靶向BDNF 介導(dǎo)的PI3K/Akt 信號通路抑制腫瘤發(fā)生。WANG 等［18］發(fā)現(xiàn)，miR?496通過靶向RASSF6 促進大腸癌細(xì)胞的遷移和上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究中通過構(gòu)建宮頸癌裸鼠移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，miR?496 過表達的裸鼠中移植瘤體積和重量明顯低于對照組，表明miR?496 抑制了裸鼠瘤體的生長，提示miR?496 可能具有抑制宮頸癌的功能。

miRNA 通過抑制目標(biāo)mRNA 和翻譯來調(diào)節(jié)基因表達，從而參與多種生物學(xué)過程。本研究利用TargetScan 發(fā)現(xiàn)miR?496 在DCUN1D1 的3′?UTR 上具有潛在的結(jié)合位點，表明DCUN1D1 是其潛在靶基因。進一步通過雙熒光素酶報告基因試驗發(fā)現(xiàn)miR?496 的確能與DCUN1D1 的3′?UTR 特異性結(jié)合并抑制其表達。

DCUN1D1 被稱為鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)癌基因，研究顯示DCUN1D1 在癌癥中具有致癌活性［19］。SHUANG等［20］研究發(fā)現(xiàn)，DCUN1D1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達升高，miR?195可通過靶向DCUN1D1抑制喉鱗狀細(xì)胞細(xì)胞的生長和侵襲。JIANG 等［21］發(fā)現(xiàn)DCUN1D1 在宮頸癌組織中較癌旁組織表達上調(diào)，且其高表達與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、生存時間縮短有關(guān)。結(jié)果與以往研究類似，本研究通過免疫熒光等實驗發(fā)現(xiàn)DCUN1D1在宮頸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，通過比較不同分期宮頸癌組織中miR?496、DCUN1D1 的表達水平發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織的臨床分期越高，DCUN1D1 的mRNA 表達水平越高，miR?496 的表達水平越低。由此可以推測，DCUN1D1的過表達能夠促進腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，增強腫瘤細(xì)胞的局部侵襲，促進惡性腫瘤的進展。

為了探究miR?496 與DCUN1D1 在宮頸癌腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制，本研究中通過體外實驗深入探究了miR?496 與DCUN1D1 對宮頸癌細(xì)胞HeLa 生物學(xué)行為的影響。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR?496 mimics 能抑制HeLa 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，但在細(xì)胞中同時高表達DCUN1D1 則能逆轉(zhuǎn)miR?496 的這種抑制效果，表明miR?496 是通過調(diào)控DCUN1D1 從而抑制宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR?496 的低表達與宮頸癌可能密切相關(guān)，進一步miR?496 可通過靶向調(diào)控DCUN1D1 抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展，miR?496 有望成為宮頸癌靶向治療的一個靶點。