楊曉蕾 李娜 范敏娟 張金桃 劉向

昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學科（昆明650101）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種常見的肺部疾病，會對肺部造成不可逆的損傷［1-3］。香煙煙霧（CSE）是導致COPD 的主要病因，可誘導氣道上皮細胞發(fā)生上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）而導致氣道重塑，進而出現(xiàn)COPD［4-5］。已有研究證實類固醇激素與肺部發(fā)育、肺部炎癥和肺癌有關。無論男女，雌激素都可在肺的局部產生，參與包括COPD 在內的肺部疾病的發(fā)生發(fā)展［6］，且雌激素已被證實可作為臨床治療哮喘和COPD 的新靶點，其能夠影響參與哮喘和COPD 發(fā)病機制的蛋白質的表達［7］。雌激素還被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中促進EMT 的發(fā)展［8］。也有研究表明，低表達的miR?21 可以緩解COPD 嚴重程度［9］，miR?21 還可通過調控SMAD 信號通路影響COPD 發(fā)展過程［10］。而在COPD 患者肺組織中SMAD 通路中分子會異常表達已被證實［10］。SMAD 信號通路的激活也會促進EMT 從而誘導COPD［11］，損傷肺血管上皮導致肺動脈高壓［12］。且有文獻證實，調控SMAD 信號通路有助于治療CSE 誘導的EMT［13］。綜上所述，本研究旨在探討雌激素通過調控miR?21/SMAD 信號通路對香煙煙霧誘導的EMT 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人肺支氣管上皮細胞（HBE）從ATCC 獲得。RPMI 1640 培養(yǎng)基、雌二醇及雌激素受體拮抗劑ICI182780（Sigma?Aldrich 公司）；Lipo?fectamine STAT3?3000 試劑盒（Thermo Fisher Sci?entific 公司）；Trizol 試劑盒（Invitrogen 公司）；Prime?ScriptTM RT 試劑盒（TaKaRa 公司）；MTT 試劑盒及所有抗體（Abcom公司）。所有引物及miR?21 mimic、miR?21 inhibitor（上海生物工程有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 香煙煙霧提取物（CSE）的制備將未過濾的香煙燃燒后產生的香煙煙霧抽進10 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基，調節(jié)培養(yǎng)基的pH 值至7.4，并通過0.22 μm 過濾器去除細菌和大顆粒，溶液的吸光度控制在320 nm（A320）和540 nm（A540），ΔOD（A320～ A540）0.9～ 1.2 為CSE 合格。將CSE 溶液（100%CSE）用培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度，1 h 內使用。

1.2.2 HBE 細胞培養(yǎng)及處理按照HBE 細胞說明書進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，將細胞用10%CSE、10%CSE 和10 nmol/L 雌二醇、10%CSE和1 μmol/L 雌激素受體拮抗劑ICI182780 同時處理細胞48 h。

1.2.3 細胞轉染嚴格按照Lipofectamine STAT3?3000 轉染試劑說明書進行實驗。

1.2.4 RT?qPCR 檢測miR?21 及E?cadherin、α?SMA、Vimentin mRNA 水平使用PrimeScriptTMRT 試劑盒按照說明書逆轉錄RNA。采用2 μL cDNA，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，H2O 7 μL，總體系共20 μL，進行PCR 反應。U6 作為miR?21 及mRNA的內源性對照，結果采用2?ΔΔCq方法進行定量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 Western blot 檢測SMAD 通路相關蛋白表達提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品在8%～10%電泳90 min，然后采用濕轉移法在250 mA電流下轉移到PVDF膜上1 h。一抗在4 ℃下孵育過夜。用PBS 洗滌3 次后，使用HRP標記的二抗（均1∶5 000）在37 ℃下孵育45 min，并通過ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像分析，Image J 分析條帶灰度值。

1.2.6 MTT 檢測HBE 增殖活力將細胞以每孔約2 × 105個細胞的密度接種于96 孔板，分別用10%CSE、10%CSE 和50 ng/mL 雌二醇、10%CSE和1 μmol/L ICI182780 處理細胞48 h，加入20 μL MTT 溶液，于37 ℃下繼續(xù)孵育4 h，加入150 μL DMSO 溶液，酶標儀檢測490 nm 下的光密度（OD）值，計算細胞活力。

1.3 統(tǒng)計學方法本文所有數(shù)據(jù)均重復3次，使用SPSS 22.6 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雌激素促進CSE 誘導的EMTRT?qPCR 結果顯示，CSE 顯著促進HBE 細胞中α?SMA（2.968± 0.32）、Vimentin mRNA（2.095 ± 0.34）表達，降低E?cadherin mRNA（0.602 ± 0.13）表達；雌二醇處理后，與CSE 組相比，α?SMA（3.956 ± 0.58）、Vimentin mRNA（3.672 ± 0.78）表達進一步增加，E?cadherin mRNA（0.360±0.08）表達進一步降低；雌激素受體拮抗劑ICI182780 處理后，與CSE 組相比，α?SMA（1.712 ± 0.20）、Vimentin mRNA（1.423 ± 0.24）表達降低，E?cadherin mRNA（0.960±0.13）表達增加，見圖1A。Western blot 結果顯示，CSE 顯著促進HBE細胞α?SMA（0.851 ± 0.07）、Vimentin 蛋白（0.883 ±0.06）表達，降低E?cadherin 蛋白（0.822 ± 0.12）表達；雌二醇處理后，與CSE 組相比，α?SMA（1.278 ±0.17）、Vimentin 蛋白（1.16 ± 0.03）表達進一步增加，E?cadherin 表達（0.423 ± 0.16）進一步降低；雌激素受體拮抗劑ICI182780 處理后，與CSE 組相比，α?SMA（0.476 ± 0.12）、Vimentin 蛋白（0.442 ±0.06）表達降低，E?cadherin 蛋白（1.378±0.09）表達增加，見圖1B。MTT 檢測顯示CSE 顯著降低HBE細胞活力（63.95%）；雌二醇處理后，與CSE組相比，HBE 細胞活力進一步下降（45.58%）；ICI182780 處理后，與CSE組相比，HBE細胞活力增加（81.63%），見圖1C，說明雌激素促進CSE 誘導的EMT 和細胞活力下降。

圖1 雌激素促進CSE 誘導的EMTFig.1 Estrogen promotes CSE?induced EMT

2.2 雌激素對miR?21 和SMAD 通路的影響RT?qPCR結果顯示，CSE顯著上調miR?21的表達（2.377±0.12）；與CSE 組相比，雌二醇處理組miR?21表達進一步上調（3.193±0.14），ICI182780處理組miR?21表達降低（1.277 ± 0.06），見圖2A。Western blot 檢測結果顯示，CSE 顯著上調p?SMAD2/SMAD2（0.804±0.09）及p?SMAD3/SMAD3（0.819±0.12）的表達。與CSE 組相比，雌二醇處理組p?SMAD2/SMAD2（1.2 ± 0.21）及p?SMAD3/SMAD3（1.20 ± 0.12）表達進一步上調，ICI182780 處理組p?SMAD2/SMAD2（0.462±0.09）及p?SMAD3/SMAD3（0.532±0.06）表達降低，見圖2B。由此可知，雌激素可上調miR?21表達，并激活SMAD 通路。

圖2 雌激素對miR?21 和SMAD 通路的影響Fig.2 Effects of estrogen on miR?21 and SMAD pathway

2.3 雌激素通過miR?21 促進CSE 誘導的EMTRT?qPCR 結果顯示，轉染miR?21 mimic 后，miR?21表達顯著增加（2.570±0.10），轉染miR?21 inhibitor后，miR?21 表達顯著降低（0.477 ± 0.05），見圖3A。與CES+ES 組相比，CES+ES+miR?21 mimic 組中E?cadherin mRNA 表達降低（0.286 ± 0.08），α?SMA mRNA（4.036±0.23）、Vimentin mRNA（3.973±0.18）表達增加。而CES+ES+miR?21 inhi 組E?cadherin mRNA 表達較CES+ES 組顯著增加（0.648±0.07），α?SMA mRNA（1.204±0.19）、Vimentin mRNA（1.978±0.53）表達較CES+ES 組顯著降低，見圖3B。

Western blot 結果顯示，與CES+ES 組相比，CES+ES+miR?21 mimic 組中E?cadherin 蛋白表達顯著降低（0.163±0.01），α?SMA 蛋白（1.124±0.09）、Vimentin 蛋白（1.070 ± 0.10）表達顯著增加。而CES+ES+miR?21 inhi 組E?cadherin 蛋白表達較CES+ES 組顯著增加（0.736 ± 0.14），α?SMA 蛋白（0.658±0.09）、Vimentin 蛋白（0.694±0.04）表達較CES+ES 組顯著降低，見圖3C。

MTT 結果顯示，雌二醇抑制了HBE 細胞的增殖活力（46.79%），miR?21 mimic 促進了雌二醇對HBE 細胞增殖活力的抑制作用（32.69%），而miR?21 inhibitor 部分抑制了雌二醇對HBE 細胞增殖活力的抑制作用（59.62%）（圖3D）。由此可知，雌激素可通過上調miR?21 的表達促進CSE 誘導的EMT和細胞活力下降。

圖3 激素通過miR?21 促進CSE 誘導的EMTFig.3 Hormones promote CSE?induced EMT through miR?21

2.4 miR?21對SMAD通路的影響Western blot結果顯示，miR?21 mimic 顯著促進p?SMAD2/SMAD2（1.251±0.07）及p?SMAD3/SMAD3（1.112±0.12）的表達；miR?21 inhibitor 顯著降低p?SMAD2/SMAD2（0.385 ± 0.05）及p?SMAD3/SMAD3（0.477 ± 0.26）的表達，見圖4。由此可知，過表達miR?21 可激活SMAD 通路，低表達miR?21 可抑制SMAD 通路激活。

圖4 miR?21 對SMAD 通路的影響Fig.4 The effect of miR?21 on SMAD pathway

2.5 雌激素通過調控SMAD 通路促進CSE 誘導的EMTWestern blot 顯示，與CSE 組相比，CSE+ES 組p?SMAD2/SMAD2（1.335 ± 0.10）及p?SMAD3/SMAD3（1.374 ± 0.31）的表達顯著增加。而SMAD通路抑制劑A?8301可部分回復雌二醇對p?SMAD2/SMAD2（0.973 ± 0.10）及p?SMAD3/SMAD3（0.975 ±0.19）表達的上調作用，見圖5A。RT?qPCR 結果顯示，經雌二醇處理后抑制E?cadherin mRNA 表達（0.302±0.03），上調α?SMA mRNA（4.368±0.63）、Vimentin mRNA（3.873 ± 0.50）的表達。A?8301 可部分回復雌二醇對E?cadherin mRNA 的抑制作用（0.393±0.31）以及對α?SMA mRNA（2.905±0.17）、Vimentin mRNA（2.795±0.22）的上調作用，見圖5B。Western blot 檢測蛋白表達，結果顯示，雌二醇顯著抑制E?cadherin 表達（0.484 ± 0.10），上調α?SMA（1.236±0.03）和Vimentin 蛋白（1.071±0.12）表達，A?8301 可部分回復雌二醇對E?cadherin 蛋白表達的抑制作用（0.898 ± 0.16）以及對α?SMA 蛋白（0.820± 0.12）和Vimentin 蛋白（0.723± 0.13）的上調作用，見圖5C。MTT 檢測結果顯示，雌二醇抑制HBE細胞的增殖（46.54%），A?8301部分抑制了雌二醇對HBE 細胞增殖活力的抑制作用（59.75%），見圖5D。由此可知，雌激素可通過激活SMAD 通路促進CSE 誘導的EMT 和細胞活力下降。

圖5 雌激素通過調控SMAD 通路促進CSE 誘導的EMTFig.5 Estrogen promotes CSE?induced EMT by regulating SMAD pathway

3 討論

COPD 以氣道炎癥、纖維化引起的持續(xù)咳嗽、咳痰、呼吸困難為典型癥狀［1-2］，吸煙是COPD 最重要的危險因素，若氣道長期暴露于香煙煙霧，會導致上皮細胞損傷、肺毛細血管系統(tǒng)破壞、上皮細胞衰老加速和氣道重塑，肺順應性的喪失最終導致COPD，而且肺癌的發(fā)生率會增加4～5 倍。CSE 可引起上皮細胞形態(tài)和功能的變化，上皮細胞失去細胞間粘附并獲得間充質細胞特征，這一生物學過程即為EMT［14-15］。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，EMT 參與了COPD 的發(fā)病［16］。

有文獻報道，COPD 的發(fā)展進程與雌激素相關［7，17］，17β?雌二醇可通過激活SMAD2/3 信號通路促進EMT的發(fā)展［18］。同時也有研究表明，雌激素信號傳導和暴露可能在包括COPD在內的肺部疾病中發(fā)揮作用［6］。因此，本課題組采用CSE 處理HBE 細胞誘發(fā)EMT，隨后以雌二醇與雌激素拮抗劑處理，探究雌激素對EMT 的作用。實驗結果顯示，CSE處理HBE 細胞后，細胞增殖活力顯著降低，抑制EMT的分子標志物E?cadherin表達降低，而促進EMT的分子標志物α?SMA 及Vimentin 表達顯著增加，雌二醇可促進這一結果，而雌激素拮抗劑ICI182780抑制這一結果，說明雌激素促進EMT 的發(fā)生。

miR?21 已被證實可增加COPD 中HBE 細胞的自噬而促進其凋亡［19］，其主要依靠SMAD 信號通路來介導細胞內外的信號傳導。研究表明，miR?21 及其下游SMAD 信號通路在EMT 過程中發(fā)揮著關鍵作用［9，20-21］。文獻報道，呼吸道中SMAD 信號通路的激活與COPD 中EMT 和肺功能的喪失有關［21］。還有研究表明，COPD 和肺癌有許多共同的生物學機制，包括慢性炎癥、基質降解、細胞增殖和抗凋亡、異常創(chuàng)傷修復和血管生成以及EMT。在COPD 患者肺組織中，SMAD 通路中的分子會異常表達，一些驅動EMT 的關鍵信號通路在肺癌中會被異常激活［10］。而且，抑制SMAD 信號通路可以減輕CSE 誘導的EMT，進而對肺癌的治療提供一個有效方向［22-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE 可上調HBE細胞中miR?21 表達，雌二醇處理后可進一步促進miR?21 表達，而ICI182780 可抑制CSE 誘導的miR?21 上調，過表達miR?21 可激活SMDA 信號通路，進而抑制HBE 細胞增殖，促進HBE 細胞發(fā)生EMT。

綜上所述，本研究通過體外實驗證實了雌二醇可通過上調miR?21 激活SMDA 信號通路，進而抑制HBE 細胞增殖，促進HBE 細胞發(fā)生EMT，促進COPD 的發(fā)展進程；探索了雌激素影響下miR?21 調控SMDA 信號通路促進COPD 發(fā)展進展的生物學機制。這一結論表明雌激素能在肺部疾病中發(fā)揮相關作用，為雌激素在CSE 誘導EMT 中的分子機制提供了一個新的視角。

但是，雌激素及其差異信號在男性和女性的肺中都存在，且在不同個體的正常生理過程中的表現(xiàn)作用也存在差異。而本研究僅通過細胞培養(yǎng)實驗探索了雌激素對香煙煙霧誘導的上皮間質轉化的影響，并未考慮患者的性別、年齡、患病程度的差異、雌激素調節(jié)劑量以及雌激素作用于個體帶來的整體作用等多重影響因素，也未考慮雌激素在COPD 發(fā)展過程中是否會與某些分子靶向藥物的使用形成協(xié)同/拮抗作用，是否會對患者造成二次傷害等。因此，下一步需深入研究雌激素在動物體內CSE 誘導EMT 過程中的作用效果、分子機制及其調控因素。