黃波 李慧雯 常誠

1廣州市紅十字會醫(yī)院普外科（廣州510220）；2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心消化內(nèi)科（廣州510623）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的結(jié)直腸系統(tǒng)惡性腫瘤之一，惡性程度排第三，死亡率排第二，全球每年新增患者約185 萬例，死亡病例約88 萬［1］。我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率近十年呈上升趨勢［2］。闡明結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找臨床診斷標志物及治療靶點，具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子（NF?E2）相關(guān)因子3（NFE2L3，Nrf3）是NF?E2 家族成員，在抗氧化作用的表達調(diào)控上發(fā)揮重要作用。NFE2L3 與乳腺癌等多種惡性腫瘤相關(guān)［3-4］，但其在結(jié)直腸癌中的作用及其分子調(diào)控機制目前未見明確報道。MicroRNA（miRNA）是一類長度約20～25 個核苷酸的非編碼RNA，高度保守，其通過與靶向基因mRNA 的3′端非翻譯區(qū)（3′ untranslational region，3′ UTR）互補，從而導(dǎo)致靶向基因mRNA 降解，從而抑制靶基因的翻譯表達［5-6］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程［7-10］。前期筆者通過生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR?26b?5p 在NFE2L3 mRNA 的3′ UTR 區(qū)存在一個潛在的靶向位點，提示miR?26b?5p 可能調(diào)控NFE2L3 蛋白水平，參與結(jié)直腸癌的生物新過程，相關(guān)研究未見報道。因此，本研究旨在探討miR?26b?5p 調(diào)控NFE2L3 在結(jié)直腸癌中的作用及其具體分子機制，分析該信號軸對結(jié)直腸癌細胞生長、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及來源人正常腸上皮細胞（NCM460）及結(jié)直腸癌細胞系（HT29、SW620 及HCT116）購自中國科學(xué)院上海細胞庫；細胞培養(yǎng)用胎牛血清，DMEM 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；TRIzol、總RNA提取試劑盒，Lippofectamine2000 購自美國Invitro?gen 公司；RIPA 裂解液、BCA 定量試劑盒等購自中國碧云天；抗NFE2L3 和GAPDH 購自美國Sigma 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；雙熒光素酶報道基因試劑盒購自美國Promega 公司。miR?26b?5p 的引物、mimics 由上海生工合成。NFE2L3質(zhì)粒構(gòu)建：通過PCR 調(diào)取NFE2L3 的全長編碼區(qū)?；厥誔CR 擴增產(chǎn)物，酶切連接到pEGFP?C1 質(zhì)粒中，通過測序確定連接成功。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細胞系在10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過轉(zhuǎn)染試劑盒對結(jié)直腸癌細胞系進行轉(zhuǎn)染，將miR?26b?5p 對照或者mimic 片段，或與NFE2L3 過表達質(zhì)粒混合以共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h 后觀察熒光，確認轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000 的說明書進行。

1.3 RT?qPCR 檢測細胞的總RNA 經(jīng)由Trizol 法提取，與液氮中保存。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），然后加入SYBR green進行PCR擴增。引物信息如下：miR?26b?5p上下游引物：5′?GGGGTTCAAGTAATTCAGG?3′和5′?CAGTGCGTGTCGTGGAGT?3′；NFE2L3 的上下游引物：5′?CTGACTGGGAAGGCAGAAAAG?3′和5′?TCAGGCTGTGATGAAAGCAA?3′；U6 的上下游引物分別為：5′?TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC?3′和5′?CCAGTGCAGGGTCCGAGGT?3′；Actin 的上下游引物分別為：5′?CCAACCGCGAGAAGAT?3′和5′?CCAGAGGCGTACAGGG?3′。

1.4 Western blot 實驗各組細胞經(jīng)RIPA 裂解液裂解變性后采用BCA 法進行蛋白定量，然后取上清進行蛋白上樣。按照Western blotting 實驗的常規(guī)步驟進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗二抗、顯影曝光。X 光片經(jīng)掃描后采用ImageJ 進行條帶灰度的分析，以目的條帶與內(nèi)參GAPDH 的灰度比值表示NFE2L3 的相對含量。

1.5 CCK?8 實驗按1∶10 的比例在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入CCK?8，配置成工作液，而后對處理后細胞進行換液，1～ 4 h 后測定A450 的值，記為day 0 的初始值。分別于轉(zhuǎn)染后day 1，day 2 和day 3 進行收樣并測定A450 的值，繪制細胞生長曲線，觀察細胞增殖情況。

1.6 Transwell 實驗細胞進行轉(zhuǎn)染處理24 h 后，通過胰酶消化進行無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度，取細胞懸液200 μL，加在Transwell 小室的上層，小室下層加入500 μL 含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，而后置于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后取出小室，PBS 清洗后擦去上室殘留細胞，4%多聚甲醛固定，然后用結(jié)晶紫染色，隨機取5 個視野，進行染色細胞計數(shù)。對于侵襲實驗，Transwell 上室預(yù)先鋪設(shè)matrigel 基質(zhì)膠。

1.7 雙熒光素酶報道基因?qū)嶒炄?shù)生長期的細胞接種于96 孔板中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，將Renilla 熒光素酶報道基因和miR?26b?5p mimic片段進行共轉(zhuǎn)染。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，檢測海參熒光素酶的發(fā)光強度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度。

1.8 克隆形成實驗細胞胰酶消化后接種5 000個細胞到6 孔培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周。鏡下觀察出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液清洗后用4%多聚甲醇固定15 min，然后進行結(jié)晶紫染色。鏡下拍照并計數(shù)相對克隆形成數(shù)量。

1.9 流式細胞術(shù)各組細胞轉(zhuǎn)染后，經(jīng)0.25%的胰酶消化，然后轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管離心（4 ℃、1 000 r/min、5 min）收集細胞，加入結(jié)合緩沖液懸浮細胞，然后加入5 μL Annexin Ⅴ?FITC 和5 μL PI，15 min 后用BD?FACSCalibur 進行流式細胞術(shù)分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)錄入GraphPad Prism 9.0.0 進行統(tǒng)計分析。所有實驗均重復(fù)3 次，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?26b?5p 和NEF2L3 在結(jié)直腸癌細胞系中的表達培養(yǎng)了人正常腸上皮細胞（NCM460）及結(jié)直腸癌細胞系（HT29、SW620 及HCT116），并通過qRT?PCR 檢測了miR?26b?5p 的水平。結(jié)果如圖1A所示，miR?26b?5p的表達水平在結(jié)直腸癌細胞系中中顯著低于正常腸上皮細胞（均P<0.05）。同樣進行了NEF2L3 在上述細胞系的檢測，qRT?PCR 的結(jié)果顯示（圖1B），NEF2L3 的mRNA 水平在結(jié)直腸癌細胞系的水平均高于正常腸上皮細胞（均P<0.05）。而western blotting 的結(jié)果顯示（圖1C），NEF2L3 的蛋白水平也存在同樣的趨勢，在癌細胞系中顯著上調(diào)，統(tǒng)計結(jié)果見圖1D（均P< 0.05）。這些結(jié)果表明，miR?26b?5p 在結(jié)直腸癌細胞系中下調(diào)，而NEF2L3 的mRNA 和蛋白水平則上調(diào)。

進一步構(gòu)建了NEF2L3表達質(zhì)粒，并在HT29細胞中過表達。CCK?8 的結(jié)果表明，過表達NEF2L3可顯著促進癌細胞生長（圖1E）；Transwell 實驗表明，過表達NEF2L3 可顯著促進癌細胞遷移和侵襲（圖1F）。

圖1 miR?26b?5p 和NEF2L3 在結(jié)直腸癌細胞系中的表達水平Fig.1 Expression levels of miR?26b?5p and NEF2L3 in colorectal cell lines

2.2 miR?26b?5p 靶向調(diào)控NEF2L3前面的結(jié)果提示miR?26b?5p 和NEF2L3 的表達水平在結(jié)直腸癌細胞系中呈現(xiàn)反向關(guān)系，而miRNA及其下游底物大多數(shù)為負向調(diào)控，提示miR?26b?5p 和NEF2L3 存在靶向關(guān)系。通過TargetScan在線數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NEF2L3 的3′UTR 區(qū)域上確實存在能與miR?26b?5p 匹配的序列（圖2A），而且該序列在人、大鼠和小鼠的NEF2L3 的3′ UTR 區(qū)域上均保守。為此，筆者合成了miR?26b?5p 的mimic 片段，并構(gòu)建了含NEF2L3 3′UTR 靶向序列的熒光素酶報道基因質(zhì)粒。見圖2B，熒光素酶報道基因的實驗結(jié)果顯示，過表達miR?26b?5p 的mimic 片段可以顯著抑制NEF2L3 的野生型（NEF2L3 WT）信號（P< 0.05），但對其突變質(zhì)粒（NEF2L3 MUT）則無效。RT?qPCR 的結(jié)果表明，過表達mimic 可顯著抑制NEF2L3 mRNA水平（圖2C）；而Western blot 的結(jié)果表明，過表達mimic 可顯著抑制NEF2L3 的蛋白水平（圖2D）。這些結(jié)果提示，miR?26b?5p 可直接靶向調(diào)控NEF2L3。

圖2 雙熒光素酶報道基因?qū)嶒烌炞CNEF2L3 作為miR?26b?5p 的靶基因。Fig.2 The dual luciferase reporter gene experiment verified NEF2L3 as the target gene of miR?26b?5p

2.3 miR?26b?5p/NEF2L3 信號調(diào)控結(jié)直腸癌細胞增殖和克隆形成選取兩株結(jié)直腸癌細胞系HT29和SW620進行功能研究。在兩株細胞系中轉(zhuǎn)染了miR?26b?5p 及其對照片段、共轉(zhuǎn)了NEF2L3 過表達質(zhì)粒及對照進行拮抗實驗。Western blot 的結(jié)果驗證了各組對NEF2L3 蛋白的影響（圖3A?B）。CCK?8 實驗表明過表達miR?26b?5p 可抑制結(jié)兩株直腸癌細胞的生長（圖3C?D，均P< 0.05），而共表達NEF2L3 則可抵消miR?26b?5p 的抑制作用，細胞生長恢復(fù)到正常水平（均P< 0.05）。同樣的克隆形成實驗結(jié)果表明，miR?26b?5p 可抑制結(jié)直腸癌細胞克隆的形成，而共表達NEF2L3 則可抵消miR?26b?5p 的抑制作用，癌細胞克隆形成能力恢復(fù)（均P<0.05，圖3E?F）。

圖3 共轉(zhuǎn)染NEF2L3 和miR?26b?5p 對結(jié)直腸癌細胞生長和細胞克隆形成能力的影響Fig.3 The effect of co?transfection of NEF2L3 and miR?26b?5p on the growth and cloning formation of colorectal cancer cells

2.4 miR?26b?5p/NEF2L3 信號調(diào)控結(jié)直腸癌細胞凋亡通過流式細胞術(shù)觀察miR?26b?5p/NEF2L3信號對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響。見圖4A，過表達miR?26b?5p mimic 顯著促進HT29 及SW620 細胞的凋亡，而過表達NEF2L3 可顯著削弱其引起細胞凋亡的作用（均P<0.05，圖4B）。

圖4 共轉(zhuǎn)染NEF2L3 和miR?26b?5p 對結(jié)直腸癌細胞凋亡能力的影響Fig.4 The effect of co?transfection of NEF2L3 and miR?26b?5p on the apoptosis of colorectal cancer cells

2.5 miR?26b?5p/NEF2L3 信號調(diào)控結(jié)直腸癌細胞增遷移和侵襲見圖5A，miR?26b?5p 可顯著抑制HT29 及SW620 細胞的遷移能力，NEF2L3 可顯著減弱miR?26b?5p 的抑制作用，使癌細胞遷移能力恢復(fù)（均P< 0.05，圖5A）。同樣的，對于結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力，miR?26b?5p 及NEF2L3 存在相同的調(diào)控趨勢（均P< 0.05，圖5B）。結(jié)合前面的結(jié)果，表明miR?26b?5p 可通過靶向調(diào)控NEF2L3，影響結(jié)直腸癌細胞的生長、克隆形成、細胞遷移和侵襲。

圖5 共轉(zhuǎn)染NEF2L3 和miR?26b?5p 對結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.5 The effect of co?transfection of NEF2L3 and miR?26b?5p on the migration and invasion of colorectal cancer cells

3 討論

miRNAs 具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，扮演著重要角色［6，11-13］。研究表明，miRNA 的表達調(diào)節(jié)失衡與結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移及惡性表型密切相關(guān)［14-15］。

腫瘤組織和外周血中存在miR?26 的異常表達，且在多種類型的實體瘤組織中可以檢測到miR?26a/b 的低表達。通過miRNA 表達譜和qPCR測定，JI 等［16］測量了455 個肝癌組織中miR?26a/b的表達，發(fā)現(xiàn)miR?26a/b 在肝細胞癌（HCC）組織中的表達顯著低于鄰近正常組織，肝癌組織中miR?26a/b 低表達的患者總生存期較短，但對干擾素α（IFN?α）治療反應(yīng)較好。且IFN?α 治療可提高miR?26 低表達的HCC 患者后的總生存率［17］。此外，miR?26 家族在食管癌組織中的低表達［18］，并且miR?26a 的低表達與食管腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［19］。在胃癌組織中也可檢測到miR?26a 水平降低，與miR?26a 高表達患者相比，miR?26a低表達患者的中位OS時間和無復(fù)發(fā)生存時間（RFS）更短［20］。ZHANG等［21］報道，乳腺癌組織中miR?26a的表達明顯低于腫瘤鄰近的正常組織，這與患者的年齡和腫瘤組織中HER2的表達有關(guān)。miR?26b 的低表達與乳腺癌患者較短的無遠處轉(zhuǎn)移生存期和總生存期相關(guān)［22］。miR?26 在某些腫瘤里面高表達。比如KIM 等［23］報道，膠質(zhì)母細胞瘤組織中miR?26a 的表達增加，且miR?26a 高表達的患者生存時間縮短。miR?26a?2 在脂肪肉瘤腫瘤組織中也高表達，miR?26a?2 的高表達與脂肪肉瘤患者的預(yù)后呈負相關(guān)［24］。LAUREN等［25］報道m(xù)iR?26a在結(jié)直腸癌樣本中低表達，且miR?26a通過調(diào)節(jié)PTEN參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。我們的研究表明，miR?26b?5p 在結(jié)直腸癌細胞系中低表達，進一步的功能實驗表明miR?26b?5p 能夠通過下游靶基因調(diào)控結(jié)直腸癌細胞系的生長、增殖、凋亡、遷移和侵襲，與以往研究結(jié)論一致。我們及前人的研究結(jié)果表明，miR?26b?5p 在惡性腫瘤中的作用具有異質(zhì)性，在肝癌、食管癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肉瘤及結(jié)直腸癌中發(fā)揮不同作用。

NEF2L3 在多種惡性腫瘤樣本中呈高表達，如淋巴瘤，乳腺癌、大腸癌，胰腺癌等，在腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)進程中起著關(guān)鍵作用。但是，對于NFE2L3 到底是抑癌基因還是促癌基因，不同腫瘤環(huán)境下有著不同發(fā)現(xiàn)。NEF2L3 對于淋巴腫瘤起著保護作用，為抑癌基因。在肝癌中，NEF2L3 高表達，抑制NEF2L3 可以抑制肝癌細胞增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，其機制可能通過Wnt/β?catenin 通路發(fā)揮作用［26］。在胰腺癌中NEF2L3 高表達，與患者TNM呈正相關(guān)，且高表達患者生存期更短，該結(jié)果提示NEF2L3 在胰腺癌中為促癌基因。BURY 等［27］發(fā)現(xiàn)NEF2L3 在大腸癌患者的樣本中顯著上調(diào)，而且小分子干擾抑制NEF2L3 可抑制大腸癌細胞的生長，增殖和遷移侵襲，其機制可能是通過DUX4/CDK1 復(fù)合物發(fā)揮作用。CHOWDHURY 等［28］則發(fā)現(xiàn)NEF2L3 在大腸癌中有著多重調(diào)控機制，正常生理狀態(tài)下，NEF2L3 可通過HRD1/VCP 復(fù)合物標記而被泛素化降解，NEF2L3 通過與sMaf 結(jié)合促進UHMK1 的表達，從而促進癌細胞的生長。而在結(jié)直腸中，NFE2L3 高表達的患者預(yù)后差，生存率低，抑制NFE2L3 可通過CCND1 和pRb1?ser807/811?？烧T導(dǎo)細胞周期停駐［29］。而實驗結(jié)果表明，NFE2L3在結(jié)直腸癌中上調(diào)，其促進癌細胞生長，是癌基因；NFE2L3 受miR?26b?5p 的調(diào)控。因此，NFE2L3 同樣存在腫瘤異質(zhì)性，可能與其上下游不同的機制有關(guān)，值得深入探索。

綜上所述，miR?26b?5p 可通過靶向抑制癌基因NEF2L3 的表達抑制腫瘤細胞的生長、遷移和侵襲，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。miR?26b?5p作為一種抑癌基因NEF2L3 作為致癌基因，可能成為結(jié)直腸癌治療的潛在新靶點。