李永濤，王振猛，楊慶山，周 健，王莉莉，劉德璽，魏海霞

（山東省林業(yè)科學研究院 a.國家林業(yè)和草原局濱海鹽堿地生態(tài)修復工程技術(shù)研究中心；b.山東耐鹽堿樹種研究國家長期科研試驗基地，山東 濟南 250014）

豆梨Pyrus calleryana為薔薇科Rosaceae 梨屬Pyrus落葉喬木，是最古老的梨屬種之一，現(xiàn)廣泛分布于華東、華南的11 個省（市、自治區(qū)）。作為我國原生梨屬植物，目前是北方栽培梨的優(yōu)良砧木之一，也是春季賞花、夏季觀果、秋季賞葉的優(yōu)質(zhì)景觀樹種，且根、葉及果實均可入藥，具有較高的經(jīng)濟價值和觀賞價值[1-2]。山東省作為豆梨最北端的適生分布區(qū)，由于地理隔離、基因漂變等多種原因，使得植株在形態(tài)特征、生態(tài)適應性等方面都形成了一系列與環(huán)境相適應的特征，部分種質(zhì)在抗逆性、觀賞性等方面均具有較好的育種價值[3]。

遺傳多樣性是物種長期進化的結(jié)果，豐富的種質(zhì)資源遺傳多樣性是育種的前提和物質(zhì)基礎[4-6]。豆梨屬于典型的異質(zhì)種質(zhì)，野生種質(zhì)經(jīng)過長期自然選擇，種內(nèi)變異豐富，優(yōu)異種質(zhì)較多，因此對豆梨野生種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究具有重要意義。目前有關(guān)豆梨種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究較少，在形態(tài)學標記方面，劉超等[7]采用主成分分析、聚類分析等方法對南方6 省78 份豆梨資源的葉片、果實等16 個表型性狀進行研究，得出不同居群間存在著豐富的變異。分子標記方面，劉晶[8]利用SSR 標記技術(shù)，得出了浙江省豆梨資源保持著較高的遺傳多樣性水平，并提出了資源保護措施。形態(tài)學標記雖具有重要地位，但很難確切地反映不同種質(zhì)間的遺傳變異特性[9-10]。AFLP分子標記技術(shù)作為種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究最有效的方法之一[11]，現(xiàn)已廣泛用于梨[12]、蘋果[13]、楸樹[14]等多年生木本植物。為明確山東省野生豆梨群體分布的遺傳多樣性特點，本研究運用AFLP 分子標記技術(shù)對采自不同區(qū)域分布的61 份豆梨種質(zhì)進行了遺傳多樣性及其親緣關(guān)系分析，以期為野生豆梨優(yōu)良種質(zhì)資源的收集、保存及育種材料的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料保存在山東省林科院鹽堿地造林試驗站豆梨資源圃內(nèi)，該材料于2019年期間采集于山東省五蓮山、九仙山、橫山、昆崳山、蒙山及嶗山6 個地區(qū)，采集時同一區(qū)域各單株間隔150 m以上，通過嫁接方式保存。其中，五蓮山3 份（編號：C1～C3），九仙山10 份（編號：C4～C13），橫山9 份（編號：C14～C22），昆崳山7 份（編號：C23～C29），蒙山23 份（編號：C30～C52），嶗山9 份（編號：C53～C61），共計61 份。

采集新梢頂端的新鮮幼嫩葉片，放入自封袋中用硅膠干燥保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 的提取

豆梨葉片DNA 的提取采用CTAB 法，提取后采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFLP 擴增及檢測

AFLP 擴增過程中的酶切連接、預擴增反應、選擇性擴增反應體系及條件等試驗流程嚴格按照李永濤等[14]的方法進行。其中限制性內(nèi)切酶選用EcoRI 和MseI 兩種，酶切與連接同時進行，在37℃保溫5 h 后，8℃保溫4 h，于4℃過夜；預擴增反應后將預擴增產(chǎn)物稀釋15 倍后再進行選擇性擴增。

PCR 擴增在Gene Amp PCR System 9600 擴增儀上進行，內(nèi)切酶和連接酶購自New England Biolabs 公司，通用引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成。擴增產(chǎn)物在4%聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

選取70～500 bp 的DNA 條帶，在同一遷移位置采取0/1 賦值記帶，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。遺傳多樣性的計算采用POPGENE version 軟件進行，計算參數(shù)包括多態(tài)位點百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測等位基因數(shù)（Na）、Nei’s 多樣性指數(shù)（H）及Shannon’s信息指數(shù)（I）；遺傳相似性系數(shù)利用NTSYSpc-2.11F 計算；依據(jù)相似性系數(shù)對各群體進行UPGMA 聚類分析[15]、主效應分析PCA（principal component analysis）和分子方差分析(AMOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP 擴增結(jié)果分析

采用篩選的8 對AFLP 引物對61 個野生豆梨單株資源進行了擴增（表1），8 對引物組合共擴增出清晰條帶1 344 條，其中多態(tài)性條帶1 340 條，占總條帶數(shù)的99.75%，平均每對引物擴增出168條帶，多態(tài)性條帶比率在99.29%～100.00%之間，說明篩選的8 對引物擴增多態(tài)性較高。同時，擴增條帶數(shù)最多的引物組合為E-AGC/M-CTC，共擴增出200 條帶，擴增效率最高（100%）；而擴增條帶數(shù)最少的引物組合為E- AGG/M-CAG，擴增出141 條帶，擴增效率最低（99.29%）。

表1 8 對引物組合擴增的AFLP 條帶結(jié)果Table 1 Amplified bands with eight pairs of AFLP primers

由圖1可以看出，引物組合P-ACG/M-CAC的圖譜顯示擴增多態(tài)性好，條帶清晰，易于分辨，說明所選用的引物組合適于豆梨資源的鑒別。

圖1 引物組合E-AAC/M-CAT 對C1～C30 號豆梨材料的AFLP 擴增圖譜Fig.1 AFLP fingerprinting of the primer pair E- AAC /M-CAT for No.C1-C30 tartary Pyrus calleryana accessions

2.2 群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)供試材料的采集區(qū)域，將61 個野生豆梨單株劃分為6 個群體。通過對6 個豆梨群體的遺傳多樣性分析（表2），各群體資源在3～23 株不等，其中M 區(qū)（蒙山）資源最多（23 株），W區(qū)（五蓮山）和K 區(qū)（昆崳山）資源最少（3 株和7 株）。雖然K 區(qū)資源份數(shù)較少，但Nei’s 多樣性指數(shù)（H=0.133 3）和Shannon’s信息指數(shù)（I=0.206 6）均較高，表明種質(zhì)資源數(shù)量的多少與遺傳多樣性無直接關(guān)聯(lián)性。

表2 6 個豆梨野生群體的遺傳多樣性分析Table 2 Analysis result of genetic diversity of six populations of Pyrus calleryana

在群體水平上，豆梨的多態(tài)位點百分率（PPB）的變化范圍為24.07%～55.09%，平均值為42.77%；觀測等位基因數(shù)（Na）為1.240 7～1.550 9，平均值為1.427 5；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.154 1～1.237 8，平均值為1.204 1；Nei’s 多樣性指數(shù)（H）為0.090 5～0.145 5，平均值為0.123 4；Shannon’s 信息指數(shù)（I）為0.134 6～0.227 1，平均值為0.191 8。其中Na、Ne、H和I指標均以蒙山和昆崳山群體的最大，五蓮山群體的最小。通過AMOVA 分析（表3）顯示，12.53%的變異來自群體間，87.47%的變異來自群體內(nèi)，這與群體的遺傳多樣性分析結(jié)果基本一致。

表3 豆梨種群的分子方差分析(AMOVA)Table 3 Molecular variance analysis (AMOVA) of Pyrus calleryana

2.3 特異性條帶分析

通過對61 個野生豆梨單株AFLP 標記的分析，8 對引物組合共產(chǎn)生特異性條帶179 條。不同引物組合擴增出的特異性條帶數(shù)存在一定差異，其中引物組合E-AGG/M-CAG 產(chǎn)生的特異性條帶最多，共擴增出32 條特異性條帶。引物組合E-AGC/M-CAC 產(chǎn)生的特異性條帶數(shù)最少，共擴增出14 條特異性條帶。而不同單株間產(chǎn)生的特異性條帶也不同，其中產(chǎn)生特異性條帶數(shù)最多的是C13號單株，共有12 條；其次是C2和C54單株，均有8 條特異性條帶；而產(chǎn)生特異性條帶最少的單株為C4、C7、C20、C22、C40、C42、C44、C47、C50、C57和C59，共11 株，均有1 條特異性條帶；此外還有7 個單株未擴增出特異性條帶，通過特異性條帶分析可以對88.52%的野生豆梨單株進行區(qū)分鑒別。

2.4 遺傳相似性分析及聚類分析

通過計算61 個野生豆梨單株間的遺傳相似性系數(shù)，不同單株間的遺傳相似性系數(shù)介于0.737 8～0.884 3 之間，平均值為0.806 8。其中，單株間遺傳相似性系數(shù)最大是C53號單株與C54號單株，達到0.884 3，且兩個單株均分布于嶗山地區(qū)，表明二者的遺傳距離最近，差異性最小。C12號單株與C39號單株間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.737 8，二者分別位于九仙山和蒙山地區(qū)，表明兩個單株間的遺傳距離最遠，差異性最大。同時，C6號單株與其它單株間的平均遺傳相似性系數(shù)最大，為0.826 7，而C39號單株與其他單株間的遺傳相似性系數(shù)平均值最小，為0.770 9，說明C6號單株與其他單株間具有較高的遺傳相似性，而C39號單株與其他單株間的遺傳相似性較小。

通過UPGMA 法對61 個單株進行聚類分析（圖2）得出，在遺傳相似系數(shù)0.806 處，可將6 個群體分為5 組。其中，第Ⅰ組包括1 個單株，C13位于九仙山；第Ⅱ組包括12 個單株，其中C32、C33、C35、C37～C41、C46號9 個單株位于蒙山，C55、C56、C61號3 個單株位于嶗山；第Ⅲ組包括2個單株，其中C21號單株位于橫山，C29號單株位于昆崳山；第Ⅳ組包括7 個單株，其中C31號單株位于蒙山，C53、C54、C57～C60號6 個單株位于嶗山；第Ⅴ組包括39 個單株，涵蓋五蓮山、九仙山、橫山、昆崳山和蒙山5 個群體的部分單株。其中，C1～C3號3 個單株位于五蓮山，C4～C12號9 個單株位于九仙山，C14～C20、C22號8 個單株位于橫山，C23～C28號6 個單株位于昆崳山，C30、C34、C36、C42～C45、C47～C52號13 個單株則位于蒙山地區(qū)。而當在遺傳相似性系數(shù)0.824 處分割時，可將第Ⅴ組分為8 個亞組，其中第1 亞組包括C1、C2號2 個單株，而第2 亞組僅C3號1 個單株，且第1、2 亞組均分布于五蓮山地區(qū)；第3 亞組包括15 個單株，其中C4、C6～C12號8 個單株分布于九仙山地區(qū)，C14～C16、C18～C20和C22號7個單株分布于橫山地區(qū)；第4 亞組包括6 個單株，為C23～C28號6 個單株，均分布于昆崳山地區(qū)；第5 亞組與第6 亞組各包括1 個單株，為C5號和C30號單株，各分布于九仙山和蒙山地區(qū)；第7 亞組包括12 個單株，分別為C34、C36、C42～C45及C47～C52號單株，均位于蒙山地區(qū)；第8 亞組包括C17號1 個單株，分布于橫山地區(qū)。聚類分析結(jié)果表明，61 個野生豆梨單株的分組情況與地理分布位置并不完全一致，部分來源相同的單株未完全聚在同一類群中。

圖261 份豆梨單株的AFLP 聚類結(jié)果Fig.2 Dendrogram of 61 accessions of Pyrus calleryana germplasm with AFLP markers

2.5 主效應分析

通過主效應分析（圖3），根據(jù)距離位置遠近61 個野生單株可劃分為5 個主要類群，其中第1個類群包括28個單株，分別來源于五蓮山、九仙山、橫山、昆崳山、蒙山；第2 個類群包括2 個單株，來源于橫山和昆崳山地區(qū)；第3 個類群包括12 個單株，來源于蒙山、嶗山地區(qū)；第4 個類群包括12 個單株，來源于蒙山地區(qū)；第5 個類群包括7個單株，來源于蒙山和嶗山地區(qū)。從圖3可以看出，6 個群體之間雖存在一定程度的基因混雜，但主效應分析結(jié)果與聚類分析的結(jié)果基本一致。

圖3 豆梨種質(zhì)材料的AFLP 主效應分析Fig.3 Principal components analysis on Pyrus calleryana germplasms using AFLP data

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

本研究基于AFLP 標記對山東省61 份豆梨種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，共獲得清晰多態(tài)性條帶1 340 條，多態(tài)性比例達99.75%，比王艷芳[16]對27 份梨資源中擴增獲得的多態(tài)性條帶比例（92.20%）高，比董美超等[17]對90 份鱷梨種質(zhì)擴增獲得的多態(tài)性條帶比例稍低（99.83%），但多態(tài)性比例均達到了90%以上。同時，本研究8對引物組合共擴增出179 條特異性條帶，通過這些特異性條帶可將88.52%的野生豆梨單株區(qū)分開來，表明AFLP 標記能很好地反映61 份野生豆梨種質(zhì)的遺傳多樣性信息，尤其是E-AAG/M-CTC、E-AAG/M-CTG 等5 對引物組合擴增條帶穩(wěn)定、多態(tài)性最高，可廣泛用于其它豆梨種質(zhì)的遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系的鑒定評價。

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是種質(zhì)資源利用的基礎，且物種的遺傳多樣性受多種因素影響[18]。本研究得出6 個野生豆梨群體的有效等位基因數(shù)、Nei’s 多樣性指數(shù)及Shannon’s 信息指數(shù)分別為1.204 1、0.123 4 和0.191 8，說明在居群水平上豆梨存在較豐富的遺傳變異度和較高的遺傳多樣性水平。通過ANOVA 分析顯示，群體間變異達到12.53%，群體內(nèi)變異達到87.47%，且遺傳變異主要來源于群體內(nèi)，這與劉晶[8]利用SSR 標記對中國豆梨種質(zhì)資源的研究結(jié)果類似。這種居群間較低的遺傳分化可能與其蟲媒授粉特性及異交為主的混合交配等植物學特性[19]緊密相關(guān)。此外，豆梨種子的傳播在減少居群間遺傳分化方面也起著非常重要的作用。因為，豆梨種實較小，味道香甜，是鳥類等動物的主要食物之一，極易造成遷徙過程中的種子攜帶，從而減少了地理隔離的影響[20-21]，因此在花粉和種子兩個方面可以同時形成遠距離傳播。

基于遺傳相似性和聚類分析結(jié)果得出，豆梨資源的聚類結(jié)果與其群體的地理分布格局具有一定的相關(guān)性，在遺傳相似系數(shù)0.806 處可將61 份資源分為5 大組，其中第Ⅰ組有1 個單株，來源于九仙山，說明該單株親緣關(guān)系較其他單株較遠；第Ⅱ組共有12 個單株，來源于蒙山和嶗山；第Ⅲ組共有7 個單株，來源于橫山和昆崳山；第Ⅳ組共有7 個單株，來源于蒙山和嶗山，說明以上各組內(nèi)同一地區(qū)或毗鄰地區(qū)資源的親緣關(guān)系相對較近；第Ⅴ組包括39 份資源，占總資源的63.93%。在相似系數(shù)為0.826 時，又可將其分為8 個亞組，其中第2、5、6、7 亞組均包括1 份資源，說明這4 份資源的親緣關(guān)系較其它單株較遠；第1 亞組共有2 份資源，均來源于五蓮山地區(qū)；第4 亞組共有12 份資源，均來源蒙山地區(qū)；第3 亞組共有15份資源，來源于九仙山和橫山。說明亞組內(nèi)資源之間親緣關(guān)系相對較近，位于同一地區(qū)的資源更傾向于聚為一類，而從地理位置上看，五蓮山、九仙山、橫山、蒙山均位于魯南地區(qū)，隸屬泰沂山脈，距離相對較近，氣候環(huán)境類似，生態(tài)因子差異較小所致。AFLP 聚類結(jié)果分析也未能將61份資源完全按照地理來源聚類，不同群體之間存在一定的交叉，部分單株之間距離雖然較遠，但仍被聚為一個類群，如蒙山與嶗山、橫山與昆崳山的部分單株，這說明豆梨的授粉特性、種子散布模式和地理分布等還不能解釋其居群結(jié)構(gòu)和遺傳分化的全部原因。此外，采集區(qū)域的氣候環(huán)境等生境因素的影響以及資源采集時可能造成的豆梨與其它梨屬資源混淆等原因也具有一定關(guān)系。需要指出的是，本研究供試材料取自山東省6 個地區(qū)，地域性相對較窄，供試樣本偏少，不利于全面綜合分析豆梨的遺傳多樣性。今后有必要對我國適生分布區(qū)的豆梨資源開展大尺度系統(tǒng)研究，以便為更加科學合理地利用其資源奠定基礎。

3.2 結(jié) 論

綜上，61 份野生豆梨種質(zhì)資源的遺傳基礎總體差異較小，親緣關(guān)系較近。來自九仙山和蒙山地區(qū)的種質(zhì)資源遺傳多樣性相對較豐富，C12號與C39號單株較為特殊，在雜交育種時可重點利用。此外，山東省野生豆梨群體間存在一定的基因交流，各群體內(nèi)遺傳分化程度大于群體間，且群體間的地理來源和遺傳變異程度并沒有嚴格的相關(guān)性，這為進一步了解山東省野生豆梨的資源現(xiàn)狀、制定合理的育種方案提供了理論依據(jù)。