譚為民，李佳，黃清水,王睿，周子聞，李彩嬌

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；2.南昌大學(xué)在校本科生科研訓(xùn)練項(xiàng)目小組，江西 南昌 330006）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）原稱為原發(fā)性膽汁肝硬化（Primary biliary cirrhosis,PBC），是一種以中小膽管持續(xù)性非化膿性炎癥浸潤(rùn)及膽汁淤積為主要特征的自身免疫病[1]。當(dāng)前臨床對(duì)PBC尚無(wú)特效的治療方法，早期診斷及熊脫氧膽酸治療方案的應(yīng)用可以明顯改善膽汁淤積癥狀及預(yù)后，但卻不能阻斷疾病進(jìn)程，晚期唯一治療選擇是進(jìn)行肝移植，嚴(yán)重危害患者的生命健康[2]。血清抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibodies，AMAs）陽(yáng)性是PBC特異性血清診斷指標(biāo)，AMAs主要靶抗原是線粒體自身抗原丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase E2 subunit，PDC-E2）[1，3]。該病患者以30歲以上中老年女性為主（男∶女約為1∶9）[4-5]，確切發(fā)病機(jī)制不清，可能與環(huán)境因素、遺傳因素、病毒和細(xì)菌感染、自身抗體、雌激素、免疫調(diào)控、趨化因子、抗原呈遞細(xì)胞、自噬、衰老、凋亡等有關(guān)，遺傳因素和炎癥因素是其重要發(fā)病因素[6-7]。

IL-17作為一類重要的炎癥因子家族，主要由Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在各類自身免疫病炎癥細(xì)胞聚集及浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用。IL-17家族包括六個(gè)家族成員，分別為IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F[8]。IL-17A和IL-17F作為其中重要的炎癥因子，起著主要的炎癥作用[9]。研究表明，PBC組較健康對(duì)照組IL-17A表達(dá)顯著升高，與疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)[10]。IL-17多個(gè)SNPs突變位點(diǎn)與自身免疫病易感性相關(guān)，IL-17A G-197A(rs2275913)位點(diǎn)多態(tài)性被證明與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性相關(guān)[11]，中東地區(qū)結(jié)直腸研究中，IL-17A rs2275913位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，IL-17A rs2275913基因表達(dá)豐度能作為結(jié)直腸癌早期監(jiān)測(cè)的基因信號(hào)[12]。一項(xiàng)關(guān)于亞洲人群胃癌風(fēng)險(xiǎn)與IL-17位點(diǎn)多態(tài)性研究顯示，IL-17A rs2275913和IL-17F rs763780兩個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)[13]。而關(guān)于IL-17相關(guān)SNPs位點(diǎn)基因突變和基因型是否與PBC易感性相關(guān)，尚未有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究。

IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025和IL-17F rs763780四個(gè)相關(guān)SNP位點(diǎn)是IL-17基因重要功能區(qū)位點(diǎn)。該研究擬在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院PBC患者中分析IL-17 SNPs基因位點(diǎn)突變和基因型分布，在基因水平探討IL-17 SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與PBC疾病易感相關(guān)性。明確PBC患者血清中IL-6、IL-12、IL-17細(xì)胞因子表達(dá)水平，分析其與健康對(duì)照組的表達(dá)差異。分析相關(guān)SNPs位點(diǎn)基因型與細(xì)胞因子表達(dá)間的關(guān)系，為PBC易感危險(xiǎn)因素的診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究納入2018年1月至2020年6月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院就診的PBC患者，同時(shí)收集該醫(yī)院同時(shí)間段體檢科健康對(duì)照組全血和血清標(biāo)本。本研究共納入56位PBC患者，60位健康人。由于PBC患者是零星出現(xiàn)的，主要采取“LIS系統(tǒng)查找-符合標(biāo)準(zhǔn)PBC患者全血和血清標(biāo)本收集-患者信息錄入Excel表格-全血及血清標(biāo)本凍存待用”的策略。匹配收集的PBC患者年齡和性別，收集相對(duì)應(yīng)健康組全血及血清標(biāo)本，兩周內(nèi)完成收集。納入研究的PBC研究病例對(duì)象均經(jīng)過(guò)臨床專業(yè)醫(yī)師的診斷，并且為初次診斷的患者。

依據(jù)2017年歐洲肝臟研究協(xié)會(huì)（European Association for the Study of the Liver,ESAL）中PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。PBC患者納入標(biāo)準(zhǔn)需符合以下三條標(biāo)準(zhǔn)中至少兩條：（1）抗線粒體抗體（AMAs）滴度大于1∶40[15]；（2）堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）或谷氨?；D(zhuǎn)移酶（Gamma-glutamyltransferase,GGT）濃度大于正常濃度上限的1.5倍，且持續(xù)時(shí)間大于24周；（3）典型的病理切片結(jié)果（如典型的中小膽管上皮細(xì)胞破壞或中小膽管炎癥浸潤(rùn)情況）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝癌；（2）近期患有嚴(yán)重傳染病和心血管疾病的；（3）接受免疫抑制藥物、增強(qiáng)藥物治療；（4）自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)、原發(fā)性硬化性膽管炎(Primary sclerosing cholangitis,PSC)與自身免疫性肝病重疊綜合征。

所有符合標(biāo)準(zhǔn)的PBC患者和健康組均按照規(guī)范采血要求進(jìn)行操作?？鼓瞎苋獦?biāo)本分裝后做好標(biāo)記，血清標(biāo)本離心分離后分裝，均保存于-80℃的低溫科研冰箱中，避免對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行反復(fù)凍融。

1.2 DNA提取 嚴(yán)格按照北京天根生物技術(shù)有限公司的全血DNA提取試劑盒操作說(shuō)明，提取PBC組和健康對(duì)照組抗凝全血中的DNA。提取的DNA的濃度和純度使用Quwell Q3000進(jìn)行測(cè)定，OD 260/OD 280比值介于1.6～1.8符合標(biāo)準(zhǔn)，DNA標(biāo)本保存于-20℃冰箱。

1.3 目的位點(diǎn)基因分型 相應(yīng)的IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025 和 IL -17F rs763780位點(diǎn)SNPs由Sanger測(cè)序進(jìn)行確定。為擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的目的DNA片段，Primer軟件設(shè)計(jì)四對(duì)引物，見(jiàn)表1，由上海生工進(jìn)行合成。25μL PCR反應(yīng)體系由5μL DNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，12.5μL GoTaq Green PCR mix混合液和3.5μL去核酸水組成。擴(kuò)增條件：95℃變性5 min，每次95℃變性30 s進(jìn)行35次循環(huán)，退火1 min，對(duì)應(yīng)引物退火溫度見(jiàn)表1，72℃延伸90 s每循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃冷藏。所有PCR擴(kuò)增目的片段送到上海生工進(jìn)行Sanger測(cè)序。

表1 對(duì)應(yīng)位點(diǎn)引物及T m溫度

1.4 細(xì)胞因子和臨床指標(biāo)測(cè)定 -80℃低溫冰箱保存的PBC組和健康對(duì)照組血清置于37℃溫箱進(jìn)行解凍，融化混勻，離心去除雜質(zhì)沉淀。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定兩組血清IL-6、IL-12、IL-17表達(dá)水平，嚴(yán)格按照細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行。并同時(shí)收集兩組對(duì)應(yīng)的血液和生化臨床指標(biāo)，進(jìn)行分析研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以（±s）表示。F檢驗(yàn)方差齊性，P＞0.05時(shí)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用U檢驗(yàn)。Haploview 4.2軟件用來(lái)分析哈溫平衡。線性相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)性分析。分類數(shù)據(jù)采用Pearson卡方檢驗(yàn)，單因素logistic回歸分析IL-17 SNPs與PBC易感相關(guān)性，以O(shè)R值和95%CI。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBC組和健康對(duì)照組臨床基本特征 56例PBC患者平均發(fā)病年齡為（56.25±14.59）歲，以中老年女性為主，男性患者14例，女性患者42例。匹配PBC患者年齡和性別收集健康人基本臨床信息，比較發(fā)現(xiàn)，PBC組的紅細(xì)胞（Red blood cell,RBC）、血 紅 蛋 白 （Hemoglobin,HGB）、血 小 板（Platelets,PLT）及血細(xì)胞比容（Hematocrit,HCT）數(shù)值顯著低于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生化指標(biāo)方面，總蛋白（Total protein,TP）、白蛋白（Albumin,ALB）、A/G指標(biāo)PBC組顯著低于健康對(duì)照組，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase,ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、A/G指標(biāo)PBC組顯著高于健康對(duì)照組，尤其是生化指標(biāo)中反應(yīng)膽汁淤積情況的指標(biāo)谷氨?；D(zhuǎn)移酶（Gamma-glutamyltransferase,GGT）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、總膽紅素（Total bilirubin,TBIL）、直接膽紅素（Direct bilirubin,DBIL），PBC顯著高于健康對(duì)照組。ALP指標(biāo)PBC組是健康組的3.2倍，GGT指標(biāo)PBC組是健康組的5.5倍，TBIL指標(biāo)PBC組是健康組的3.3倍，DBIL指標(biāo)PBC組是健康組的12.9倍，PBC組均遠(yuǎn)高于健康對(duì)照組，見(jiàn)表2。

表2 PBC組與健康對(duì)照組基本臨床特征

2.2 PBC組和健康對(duì)照組IL-17 SNPs位點(diǎn)突變和基因型分析 PBC組和健康對(duì)照組IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025 和 IL -17F rs763780四個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型進(jìn)行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)基因平衡分析，兩組四個(gè)SNPs基因型P＞0.05時(shí)，分布符合哈-溫平衡，具有研究意義，見(jiàn)表3。

表3 PBC組和健康對(duì)照組哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)兩組四個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型和基因頻率進(jìn)行顯性模型、隱性模型、共顯性模型分析。IL-17A rs10484879和IL-17F rs763780基因位點(diǎn)三種基因型模型中，PBC組和健康對(duì)照組表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-17A rs2275913位點(diǎn)隱性模型和共顯性模型中，PBC組基因型AA表達(dá)少于健康人群中AA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隱性模型中，AA基因型OR值和95%CI分別為0.383，（0.157～0.935）；共顯性模型中，AA基因型OR值和95%CI分別為0.330，（0.109～0.998）。IL-17A rs3819025位點(diǎn)顯性模型和共顯性模型中，PBC患者GA和AA基因型遠(yuǎn)多于健康人這兩種基因型表達(dá)，GG基因型表達(dá)少于健康人表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯性模型中，GA+AA基因型組合OR值和95%CI分別為11.600，（2.527～53.259）；共顯性模型中，GA基因型OR值和95%CI分別為10.150，（2.186～47.127）。PBC組和健康組突變位點(diǎn)基因型和等位基因表達(dá)和頻率，見(jiàn)表4。

表4 PBC組和健康對(duì)照組基因型和基因頻率分析結(jié)果

2.3 PBC組和健康對(duì)照組細(xì)胞因子表達(dá)水平 分析兩組血清中IL-6、IL-12、IL-17A表達(dá)水平，PBC組均顯著高于健康對(duì)照組，見(jiàn)表5。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PBC組中IL-17A表達(dá)與IL-6表達(dá)成正相關(guān)（r=0.4818,P=0.0003）,圖1，也與IL-12表達(dá)成正相關(guān)（r=0.3714,P=0.0048）,圖2。IL-6表達(dá)水平未發(fā)現(xiàn)與IL-12表達(dá)水平存在相關(guān)性（P＞0.05）。

圖1 PBC組IL-17A與IL-6表達(dá)相關(guān)性

圖2 PBC組IL-17A與IL-12表達(dá)相關(guān)性

表5 PBC組和健康組細(xì)胞因子表達(dá)水平

2.4 PBC組IL-17A rs3819025位點(diǎn)不同基因型細(xì)胞因子及生化指標(biāo)表達(dá) 分析IL-17A rs3819025位點(diǎn)不同基因型細(xì)胞因子及生化指標(biāo)表達(dá)差異，見(jiàn)表6。反應(yīng)膽汁淤積指標(biāo)TBIL、DBIL、ALP、GGT，AA+GA基因型人群均高于GG型人群。IL-17A表達(dá)水平AA+GA基因型人群也高于GG型人群。IL-6、IL-12表達(dá)水平AA+GA基因型人群低于GG型人群，但所有差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 PBC組細(xì)胞因子及生化指標(biāo)不同基因型表達(dá)

3 討論

收集2018年1月至2020年6月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診PBC患者56例納入研究，并匹配其年齡和性別收集60例健康對(duì)照組。分析可知，江西PBC患者以中年女性為主，平均患者年齡（56.25±14.59）歲，男女比例為1∶3。近幾年流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著醫(yī)療水平提高PBC確診率的提高，PBC患者男女比例有所增加，甚至有調(diào)查PBC患者男女比例為1∶2.1[16]，這與該研究分析結(jié)果較為符合。比較兩組肝生化指標(biāo)，PBC較健康對(duì)照組ALT、AST指標(biāo)顯著升高，ALT約為對(duì)照組4倍，AST約為對(duì)照組5倍。慢性肝炎尤其是肝纖維化時(shí)，AST升高程度高于ALT升高程度[17]。PBC患者肝損傷為慢性肝炎，且可能進(jìn)展為肝纖維化。PBC患者易出現(xiàn)黃疸、瘙癢、疲憊等并發(fā)癥。比較兩組DBIL、IBIL和TBIL指標(biāo)，PBC組三項(xiàng)指標(biāo)均顯著升高，以DBIL升高尤甚，約為健康對(duì)照組的16倍，IBIL約為健康組2倍，PBC患者以膽汁淤積梗阻性黃疸為主。PBC組ALP指標(biāo)約為健康對(duì)照組4倍，PBC組GGT指標(biāo)約為健康對(duì)照組7倍。ALP高于正常值上限1.5倍，是確診PBC的條件之一[14]。ALP升高不僅僅出現(xiàn)在膽汁淤積性肝病中，還有諸多生理性或病理性原因可引起ALP升高[18]（如骨骼性疾病，青少年生長(zhǎng)期，婦女妊娠期等）。臨床上通常結(jié)合GGT指標(biāo)和DBIL判斷患者膽汁淤積情況，并結(jié)合AMAs陽(yáng)性用于確診PBC[19]。綜上所述，PBC患者中小膽管的損傷，造成患者出現(xiàn)以DBIL升高為主，IBIL輕微升高為特征的膽汁淤積性黃疸，引起ALP、GGT指標(biāo)升高，導(dǎo)致肝臟的慢性炎癥損傷，肝臟蛋白合成能力受損，白蛋白合成下降，持續(xù)存在的肝臟炎癥可能引起肝臟纖維化?；颊唧w內(nèi)免疫系統(tǒng)激活，相應(yīng)IgG和IgM抗體合成增加，GLB升高明顯。

PBC作為一種復(fù)雜的自身免疫病，盡管其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，但我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到遺傳因素、免疫因素和炎癥因素在PBC發(fā)病中起重要作用[20]。作為關(guān)鍵的促炎因子之一，IL-17A相關(guān)SNPs在多種自身免疫病研究中已被證明與疾病易感性存在相關(guān)性，但結(jié)果各異[21-22]。IL-17A位于人染色體6q21，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成[23]，有關(guān)IL-17A基因位點(diǎn)多態(tài)性與PBC易感相關(guān)性分析鮮有研究。本研究分析IL-17A rs10484879、rs2275913、rs3819025和IL-17F rs763780四個(gè)SNPs位點(diǎn)與PBC易感相關(guān)性。首先對(duì)兩組四個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行哈-溫平衡檢測(cè)，其分布頻率均符合哈-溫平衡，說(shuō)明兩組基因均無(wú)群體偏差，具有人群代表性。PBC組和健康組中，rs10484879和rs763780 SNPs位點(diǎn)基因突變和基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這兩個(gè)SNPs位點(diǎn)基因突變與PBC易感性不存在相關(guān)性。

IL-17A rs2275913 SNPs位點(diǎn)中野生型等位基因?yàn)镚，A為其突變型等位基因。在隱性模型和共顯性模型中，PBC組AA基因型攜帶者均少于健康對(duì)照組AA攜帶者。隱性模型中，GA和GG基因型攜帶者PBC易感性是AA基因型攜帶者的2.61倍；共顯性模型中，GG基因型攜帶者PBC易感性是AA基因型攜帶者的3.03倍。提示AA基因型攜帶者PBC易感性降低，AA基因型可能是PBC保護(hù)基因型。IL-17A rs2275913位點(diǎn)突變型A等位基因可能為PBC保護(hù)因素。

IL-17A rs3819025 SNPs位點(diǎn)，PBC患者突變型基因位點(diǎn)A顯著多于健康對(duì)照組。顯性模型中，PBC組GA+AA基因型頻率顯著高于健康對(duì)照組中出現(xiàn)頻率，GA+AA基因型攜帶者PBC易感性是GG基因型攜帶者的11.60倍；共顯性模型中，GA基因型攜帶者PBC易感性是GG基因型攜帶者的10.15倍。提示rs3819025 SNPs位點(diǎn)A等位基因突變，會(huì)增加PBC疾病易感性，GA和AA基因攜帶者具有更高的PBC患病風(fēng)險(xiǎn)。IL-17A rs3819025 SNPs位點(diǎn)突變型A等位基因會(huì)顯著增加PBC易感性，是PBC危險(xiǎn)因素。

分析rs3819025 SNPs位點(diǎn)不同基因型生化指標(biāo)，AA+GA基因型ALP、GGT、TBIL、DBIL指標(biāo)較GG基因型表達(dá)水平升高，提示A突變有可能與PBC中膽汁淤積有關(guān)。分析rs3819025 SNPs位點(diǎn)不同基因型細(xì)胞因子表達(dá)，GA+GA基因型較GG基因型IL-17表達(dá)水平升高，提示IL-17A rs3819025位點(diǎn)突變有可能會(huì)增強(qiáng)IL-17相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)IL-17表達(dá)，并進(jìn)一步引起其他多種細(xì)胞因子表達(dá)差異。而相關(guān)作用機(jī)制需要后續(xù)研究進(jìn)一步探索?？偠灾?，IL-17A rs2275913和rs3819025 SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與PBC易感性相關(guān)。rs2275913位點(diǎn)AA基因型攜帶者PBC易感性較低，rs3819025位點(diǎn)GA和AA基因型攜帶者易發(fā)生PBC。IL-17 SNPs多態(tài)性可能作為預(yù)防診斷PBC的候選基因，從而為PBC早期診斷和預(yù)防提供相應(yīng)依據(jù)。

比較兩組炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-12和IL-17A表達(dá)水平，PBC組三者表達(dá)均高于健康對(duì)照組。分析可知，PBC中IL-17A的表達(dá)與IL-6和IL-12的表達(dá)成正相關(guān)，炎癥因子在PBC病情進(jìn)展相互影響，影響各自的分泌產(chǎn)生。分析PBC組rs3819025 SNPs位點(diǎn)不同基因型對(duì)細(xì)胞因子和生化指標(biāo)的影響，GA+AA突變型基因型較GG野生型基因型IL-17表達(dá)水平升高，相關(guān)膽汁淤積和肝損傷指標(biāo)表達(dá)也有所升高。但由于可能納入研究標(biāo)本量較少，所有差異均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，需后續(xù)研究擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。

該研究提示，IL-17A rs2275913和rs3819025 SNPs位點(diǎn)多態(tài)性可能與PBC易感性相關(guān)。rs2275913位點(diǎn)AA基因型攜帶者PBC易感性較低，是PBC發(fā)病保護(hù)因素；rs3819025位點(diǎn)GA和AA基因型攜帶者易發(fā)生PBC，是PBC發(fā)病危險(xiǎn)因素。IL-17 SNPs多態(tài)性研究可為PBC早期診斷和預(yù)防提供預(yù)測(cè)依據(jù)。