陳潔梅

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 230031）

相比低溫保存而言，精子的常溫保存操作簡便，成本低廉，便于短期運(yùn)輸，可以有效提高養(yǎng)殖效益，是一種簡單易學(xué)的保種方法。在精子保存過程中，精子質(zhì)膜易受到外部環(huán)境的影響，致使質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和理化特性發(fā)生改變，使精子活力顯著下降或喪失。

乙酰水楊酸 （Acetylsalicylic acid，ASA）， 又稱阿司匹林 （Aspirin），為一種白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭或微帶醋酸臭，微溶于水，為水楊酸衍生物，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱，預(yù)防心臟病發(fā)作和中風(fēng)[1]，誘導(dǎo)各種癌細(xì)胞凋亡[2]，作為常用的細(xì)胞質(zhì)膜保護(hù)劑，在治療人的矽肺病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中廣泛應(yīng)用，簡稱ASA[3～5]。在精子保存過程中尚未有相關(guān)研究。在本次試驗(yàn)中，以綿羊精子為觀察對象，通過檢測質(zhì)膜完整性（Membrane integrity，MI）和頂體完整性 （Acrosome integrity ，AI），探討在常溫條件下ASA對綿羊精子活力，質(zhì)膜和頂體的保護(hù)作用。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

從安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)江淮分水嶺試驗(yàn)站選取7只精液品質(zhì)優(yōu)良、行為活躍，年齡為2歲的杜泊羊作為采精對象。試驗(yàn)公羊采用全舍飼單獨(dú)飼養(yǎng)，配有運(yùn)動場。使用全株青貯甜高粱作為日糧，同時每天補(bǔ)飼適量苜蓿和雞蛋，稻草自由采食、飲水。采精頻率為每兩天1次，采精時間均選在下午飼喂之前，采精后放牧，增加運(yùn)動量。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

Tris（Solarbio， Cat.No.T8060）； D-果糖 （源葉生物，J31M9R62568）； 檸檬酸-水物 （源葉生物，J12A9R58108）； 青霉素鈉 （源葉生物，W25/9H59574）；鏈霉素硫酸鹽 （源葉生物，H23A9Z68568）；D（+）-無水葡萄糖 （源葉生物，Z23A9X68427）；PBS磷酸緩沖液 （源葉生物，L11S9G69902）；檸檬酸三鈉 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，6132-04-3） （源葉生物，）；戊二醛固定液 （2.5%） （源葉生物，L08S9G699 05）；甲醛溶液 （上海振企化學(xué)試劑有限公司，XK13-201-00395）；吉姆薩染色液 （源葉生物，L08S9G69895）。

1.1.3 試驗(yàn)器材

數(shù)顯不銹鋼電熱板 （金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠，DB-2）；生物顯微鏡 （Nikon，JAPAN，Y-T TV）； 顯微鏡熱臺 （Gold Cyto，85-240VAC）； 微型計算機(jī) （HP，1HM21AV）； 精子成像系統(tǒng) （BASLER，acA780-75gc）；潔凈工作臺 （上海博迅，Boxun）；數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州普天儀器，HH-S6）；低速離心機(jī) （安徽中科中佳，SC-3614）；精子活力測定軟件 （SPERM CLASS ANALYZER，SCA）； 顯微鏡成像裝置 （OPLENIC，PSC600-05C）； 計數(shù)及拍照軟件 （OPLENIC-CAMERA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制及分組

將1.449g D-果糖、1.725g D （+）-無水葡萄糖、4.0595g Tris、1.978g檸檬酸-水物、115.000IU青霉素鈉和115.000IU鏈霉素硫酸鹽倒入雙蒸水 （高壓過的蒸餾水）攪拌至溶解，定容至100ml。置于4℃冰箱保存、備用，此液可長期保存。

將精液稀釋液分為 4組 （n=3）： Control組 （0mm/L）、 A1組 （20mm/L）、 A2 組 （50mm/L）和 A1 組 （100mm/L）。

1.2.2 精液保存程序

結(jié)合傳統(tǒng)的一步稀釋法和兩步稀釋法，在精液中先將一半稀釋液注入精液后，用移液槍槍頭將精液和稀釋液混勻，使精子均勻地分布于稀釋液中，再將另一部分稀釋液注入精液，以此降低大量稀釋液注入精液導(dǎo)致的副作用，最終比例為1:8，將稀釋好的精液分裝為待檢次數(shù)的2倍，用封口膜封口，防止進(jìn)水，放入20℃恒溫水浴鍋避光保存，0、6、24、48、72、96h時分別進(jìn)行檢測。

1.2.3 精子活力檢測方法

將待檢精液置于38℃數(shù)顯不銹鋼電熱板上預(yù)熱5min，取3μl精液滴于提前預(yù)熱好的載玻片上，蓋上蓋玻片，放于37℃的顯微鏡熱臺上，利用SCA軟件在顯微鏡下檢測精子的活力。每次檢測至少取兩份精液進(jìn)行檢測，記錄精液活力及參數(shù)的平均值，每份精液的活力需在3個不同視野中進(jìn)行軟件統(tǒng)計，取均值作為結(jié)果。

精子活力=快速前向運(yùn)動 （a級）+慢速前向運(yùn)動 （b級）

1.2.4 質(zhì)膜完整率檢測

低滲腫脹試驗(yàn) （HOST）檢測精子的MI，用838mg的檸檬酸三鈉和1.38g果糖溶在100ml雙蒸水中，150mOsm的滲透壓檢測效果最好。

分裝HOST放于37℃恒溫?zé)崴″?min以上，在300μl的HOST液中注入50μl的精液，用移液槍將HOST液與精液輕輕混勻，封口膜封口，然后將HOST液與精液的混合液放于37℃恒溫?zé)崴″佒蓄A(yù)熱，60min后取10μl混合液滴于載玻片抹片，風(fēng)干，2.5%戊二醛固定15min，用純水沖洗，風(fēng)干，在40×的顯微鏡下，利用OPLENIC-CAMERA軟件在計算機(jī)屏幕上隨機(jī)計數(shù)100個精子。

計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：尾尖膨出、主片彎曲自折或尾尖卷曲的精子為質(zhì)膜完整的精子；而精子依舊為直尾，沒有任何彎曲特征的精子被視為質(zhì)膜功能受損的精子。

MI/%=彎曲精子數(shù)/精子總數(shù)×100

1.2.5 頂體完整率檢測

吸取10μl待檢精液，滴于載玻片抹片，待其風(fēng)干后，用1ml 4%的甲醛固定液布滿整個玻片，靜止固定15min，用純水洗去4%甲醛，自然風(fēng)干。吸取約0.8ml吉姆薩染色液，使之均勻地分布于整個抹片。90min后用純水沖洗，自然風(fēng)干。利用40×的光學(xué)顯微鏡，投影在電腦上利用OPLENIC-CAMERA軟件隨機(jī)計數(shù)100個精子。

計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：正常精子頂體的特征為：頂體較為完整，完整著色，頂體不完整的精子特征為：頭部缺陷 （微觀和宏觀的頭部缺陷、頭部斷裂、梨形頭）、中片異常、近端、遠(yuǎn)端、附件、尾部異常 （尾巴纏繞頭部，尾巴中間彎曲、雙尾）。

AI/%=頂體完整精子數(shù)/精子總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果均用 “平均值 （mean）±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。單因素分析確定差異顯著性。使用組間兩兩比較確定組間差異顯著性，＜0.05表示差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 乙酰水楊酸對精子活力的影響

由圖1可知，48h時A2組的精子活力極顯著高于對照組，72h時A3組的精子活力極顯著高于對照組。這說明50 mM的ASA有利于48h內(nèi)的精子常溫保存，100mM的ASA更有利于72h內(nèi)的常溫保存。

2.2 乙酰水楊酸對精子質(zhì)膜完整性的影響

由圖2所示，48h時，A3組的MI顯著高于對照組 （45.8±4.32%vs40.4±5.03%， ＜0.05）； 在精子保存后期，A3組MI較對照組高，進(jìn)一步說明ASA對精子質(zhì)膜的保護(hù)作用。

2.3 乙酰水楊酸對精子頂體完整性的影響

由圖3可知，48h時，A1和A2組的AI顯著高于對照組（95.2±0.84%、 95.2±0.84%vs 96.4±1.14%， ＜0.05）； 72h 時， 添加 100mM的 A3組極顯著高于對照組 （93±1.41%vs 87.8±1.3%， ＜0.01）。說明在精子長期保存中，添加了100mM的ASA更有利于保護(hù)精子頂體。

3 討論

精子常溫保存除了對營養(yǎng)物質(zhì)的需要，更需要保護(hù)精子質(zhì)膜和頂體的完整性，這是延長精子壽命的必備條件。精子質(zhì)膜和頂體是影響精子整體質(zhì)量的重要因素，包括精子活力[6]。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，加入50mM的ASA有利于精子48h內(nèi)的保存，而加入100mM的ASA更有利于72h內(nèi)的精子保存，但生產(chǎn)上，常溫保存一般不會達(dá)到72h，再者，適量的ASA對細(xì)胞有保護(hù)作用，而過量的ASA對細(xì)胞有毒害作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，過量的ASA對雄性動物生殖器官有損害作用[8～10]，所以，在稀釋液中加入50mM的ASA為最佳選擇。