白 燕，辜依海，劉玥彤，余宏鑫，賀 凡，孫德琴

肺炎是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)常見的并發(fā)癥，同時也是導(dǎo)致COPD患者死亡的重要誘因[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，COPD患者合并肺部感染的發(fā)生率為3.9%，而肺部感染會使COPD患者病情進一步加重，其中細菌感染在COPD病情惡化過程中起著極其關(guān)鍵的作用[2]。肺炎克雷伯菌是COPD合并肺炎常見的致病菌，而隨著抗生素在臨床的大面積使用，肺炎克雷伯菌的耐藥性不斷升高，其中最重要的因素就是大量產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLS)[3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌存在一定的差異，其基因型并不相同，從而反映其耐藥機制的復(fù)雜多樣[4]。為詳細了解COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌的耐藥性及其基因型，本研究通過對COPD合并肺炎患者的痰液標(biāo)本進行細菌培養(yǎng)和鑒定，并分析產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分布情況，旨在為臨床合理選擇抗感染藥物治療COPD合并肺炎提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月—2020年1月我院收治的328例COPD合并肺炎作為研究對象，其中男201例，女127例；年齡45～72(60.91±8.36)歲；COPD病程5～16(11.58±2.31)年；來源于門診33例，來源于住院病房295例。

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗：采用一次性吸痰管收集所有患者的痰液標(biāo)本，立即置于無菌管中，按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[5]中的方法進行細菌培養(yǎng)。使用API全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行細菌鑒定，儀器購自法國生物梅里埃股份有限公司。Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)平板購自杭州天和微生物試劑有限公司。使用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，藥敏試紙購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603及大腸埃希菌ATCC25922。選擇氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明、慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、美羅培南及亞胺培南進行藥敏試驗。

1.2.2ESBLS檢測：使用雙紙片法及表型確證試驗對肺炎克雷伯菌是否產(chǎn)ESBLS進行檢測。應(yīng)用無菌生理鹽水稀釋標(biāo)本菌株懸濁液，直至0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫?，并且均勻地涂布于Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)平板上面；然后將30 μg的頭孢他啶紙片、30 μg/10 μg的頭孢他啶/克拉維酸紙片、30 μg的頭孢噻肟紙片、30 μg/10 μg的頭孢噻肟/克拉維酸紙片置于Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)平板上面；35 ℃條件下孵育16～18 h；測量頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片，以及頭孢他啶/克拉維酸紙片、頭孢噻肟/克拉維酸紙片的抑菌環(huán)直徑，若頭孢他啶/克拉維酸紙片、頭孢噻肟/克拉維酸紙片的抑菌環(huán)直徑分別較頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片抑菌環(huán)直徑的擴大值≥5 mm，則明確為產(chǎn)ESBLS菌株。

1.2.3ESBLS基因型檢測：首先，對產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌進行培養(yǎng)；然后提取產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌總DNA，再應(yīng)用PCR法分析產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型。PCR反應(yīng)體系包括0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1 U Taq DNA聚合酶、1×PCR緩沖液以及100 ng DNA模板，總反應(yīng)體積為25 μl；PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min、72 ℃延伸10 min，共25個循環(huán)。ESBLS基因型包括質(zhì)粒誘導(dǎo)酶(TEM)、β-內(nèi)酰胺耐藥相關(guān)酶(SHV)、頭孢噻肟酶(CTX-M)、鄰氯青霉素水解酶(OXA)，各基因型引物序列見表1。

表1 ESBLS基因型引物序列

1.3觀察指標(biāo) ①統(tǒng)計COPD合并肺炎患者肺炎克雷伯菌檢出率；②記錄COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌對常用抗生素的耐藥性；③分析COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。耐藥性檢測結(jié)果、基因型分析結(jié)果等計數(shù)資料以率(%)表示。

2 結(jié)果

2.1肺炎克雷伯菌檢出率 收集COPD合并肺炎患者痰液標(biāo)本共328份，培養(yǎng)出病原菌131株，分離出肺炎克雷伯菌93株，共檢出產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌48株，檢出率為51.61%。

2.2產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥性檢測 藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，COPD合并肺炎患者檢出的48株產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶的耐藥率均為100%；對氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明耐藥率均>60%，分別為68.75%和60.42%；對慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為39.58%、35.42%、35.42%、29.17%和20.83%；對阿米卡星的耐藥率為8.33%，敏感性為91.67%；對亞胺培南和美羅培南耐藥率均為0，敏感性為100%。

2.3產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分析 通過PCR法對48株產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌進行基因型分析，結(jié)果顯示，3株為單基因型，其余為雙基因型或多基因型，占比93.75%；48株產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型以SHV、CTX-M-1為主，分別為38株(79.17%)、36株(75.00%)，基因型TEM、CTX-M-9、CTX-M-2、CTX-M-3、OXA分別為22株(45.83%)、11株(22.92%)、4株(8.33%)、3株(6.25%)、2株(4.17%)。見表2和圖1。

表2 COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型分析(n=48)

圖1 部分ESBLS基因型PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

3 討論

COPD是一種全球負擔(dān)巨大且日益嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，居全球死因的第三位[6-8]。肺部感染是導(dǎo)致COPD急性發(fā)作的重要因素，革蘭陰性菌是COPD合并肺炎的主要病原菌[9-11]。一項關(guān)于COPD合并下呼吸道感染病原菌分布和耐藥性的回顧性分析也發(fā)現(xiàn)，其主要病原菌為革蘭陰性菌，且以肺炎克雷伯菌的檢出率最高，占比30.3%[12]。但近年來，肺炎克雷伯菌由于產(chǎn)ESBLS而容易出現(xiàn)耐藥性[13]。肺炎克雷伯菌耐藥性增高不僅會使抗感染治療失敗，延長住院時間，增加經(jīng)濟負擔(dān)，還會提升患者病死率[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，采集328份COPD合并肺炎患者痰液標(biāo)本培養(yǎng)出病原菌131株，并分離出肺炎克雷伯菌93株，共檢出產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌48株，檢出率為51.61%，與相關(guān)文獻報道相似[16-17]，但檢出率較唐雯娟等[18]報道的29.57%及劉勇等[19]報道的37.65%明顯升高。考慮與COPD患者免疫力較差，以及持續(xù)、大劑量地使用抗生素有關(guān)。提示COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌現(xiàn)狀已發(fā)展到較為嚴(yán)重的階段，此問題迫切需要解決。本研究進一步藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌除對亞胺培南、美羅培南、阿米卡星敏感性>90%以外，已對大部分的抗生素表現(xiàn)出耐藥性，對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶耐藥率最高，達100%，其次為氨芐西林/舒巴坦、復(fù)方新諾明，耐藥率均>60%，對慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦均表現(xiàn)出不同程度的耐藥。具體而言，產(chǎn)ESBLS可能是肺炎克雷伯菌對大部分頭孢菌素類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因，如若長時間、高劑量地應(yīng)用頭孢菌素類藥物，在藥物的作用下，細菌ESBLS的產(chǎn)酶量將明顯升高，從而造成肺炎克雷伯菌產(chǎn)生新的耐藥性[20]。而肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素藥物敏感性為100%，可能與此類藥物對酶穩(wěn)定性較好，且不容易被ESBLS所破壞存在關(guān)聯(lián)，但隨著碳青霉烯類抗生素不斷地被臨床經(jīng)驗性使用，其耐藥性也在逐漸增加[21]。因此，針對產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌，選擇抗生素時應(yīng)當(dāng)十分慎重。

本研究鑒定的48株產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌中，雙基因型或多基因型占比93.75%，且以SHV、CTX-M-1基因型檢出率最高，TEM、CTX-M-9次之，最后為CTX-M-2、CTX-M-3、OXA，與楊燕文等[22]報道的結(jié)果類似。表明產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型呈現(xiàn)多樣性，含多種產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶基因的肺炎克雷伯菌耐藥譜更寬，另外還可以通過質(zhì)粒介導(dǎo)而使多重耐藥菌傳播與流行。基于COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌基因型的復(fù)雜性及多樣性，甚至呈現(xiàn)區(qū)域性流行狀況，故不同地區(qū)需要加強對本地菌株耐藥性的監(jiān)測，從而及時預(yù)防、控制COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥性蔓延，并指導(dǎo)合理選擇抗生素治療。

綜上所述，COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥狀況控制差，菌株攜帶多種耐藥基因現(xiàn)象較嚴(yán)重，需要引起高度重視。了解COPD合并肺炎患者產(chǎn)ESBLS肺炎克雷伯菌耐藥狀況以及菌株基因型分布，有利于預(yù)測COPD合并肺炎患者對抗生素的耐藥趨勢，進而指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用抗生素進行治療。